猪伪狂犬病油乳剂灭活疫苗免疫效力和保存期试验

用华中农业大学畜牧兽医学院病毒研究室研制的猪伪狂犬病(PR)油乳剂灭活疫苗中试产品(9701、9702、9703、9704批)免疫1月龄断奶仔猪,免疫后42 d中和抗体指数到达高峰,180 d后中和抗体效价仍为阳性;于第1次免疫后56 d加强免疫,出现较高的中和抗体并持续至270 d.疫苗置20～25℃3个月、4～8℃18个月,物理性状保持不变,效力试验仍能获得较高抗体水平,对伪狂犬病病毒(PRV)鄂A株强毒的保护率为100%.     

地塞米松与提高猪伪狂犬病病毒分离率的关系

伪狂犬病病毒对不同年龄猪的致病作用不同,多数成年猪感染该病毒后不会表现临床症状。因此,猪群感染伪狂犬病,除用血清学方法检测外,病毒分离是诊断该病的重要依据。本试验用地塞米松处理获得免疫的种猪,进行病毒分离试验,旨在提高获得免疫种猪的病毒分离率,进一步分析健康带毒猪的流行病学特点。 (一)材料与方法 1.试验猪:试验种猪来自美国北卡罗来纳州某猪育种公司的14个种猪场。这些猪场经常发生猪伪狂犬病,并多次免疫接种过猪伪狂犬病灭活疫苗(14个猪场使用的PRV灭活疫苗均为美国Nordon实验室生产出售的商品苗)。从每场随机抽取1.5～4岁的兰特瑞斯与大白的杂种猪4头,共56头,按猪场的顺序分为14个组。     

PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原优势区基因真核表达质粒的构建及其免疫效果

采用PCR法扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2抗原优势区(ORF2′)基因和猪细小病毒(PPV)VP2基因,将目的基因定向插入真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2′-VP2。将重组质粒免疫小鼠,同时设立PCV亚单位疫苗、PPV灭活疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,PCV2和PPVIgG抗体效价进行了检测。结果表明,从免疫后第7d起,pCI-ORF2′-VP2免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和抗PCV2、PPV的特异性抗体效价都显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于空载体对照组,且重组质粒组在第21～42d诱导的免疫水平显著或极显著强于PPV灭活疫苗组。证实,构建的重组质粒pCI-ORF2′-VP2能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

鸡IL-2和IL-15基因真核表达质粒对禽流感疫苗的免疫增强作用

根据GenBank中的鸡IL-2和IL-15序列设计了2对引物,采用RT-PCR法从山地乌骨鸡外周血淋巴细胞RNA中克隆了IL-2和IL-15基因,与pcDNA3.1连接构建了真核表达质粒pDNAIL-2和pDNAIL-15,研究了其对禽流感灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示,免疫后第10d,pDNAIL-15 AI灭活疫苗组和pDNAIL-2 AI灭活疫苗组HI抗体水平显著高于AI灭活疫苗组(P<0.05)。免疫后第10 d,pDNAIL-15 AI灭活疫苗组CD4 淋巴细胞百分含量显著高于pDNAIL-2 AI灭活疫苗和AI灭活疫苗组(P<0.05);免疫后第23 d,pDNAIL-2 AI灭活疫苗组CD4 淋巴细胞百分率显著高于pDNAIL-15 AI灭活疫苗和AI灭活疫苗组(P<0.05)。证实pDNAIL-2和pDNAIL-15能提高禽流感灭活疫苗的免疫效果。     

猪伪狂犬病病毒JSZ株的分离鉴定及其病毒核酸的分布规律

用猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性引物对江苏省某猪场疑似猪伪狂犬病的病死仔猪组织病料进行了PCR鉴定,结果可扩增到特异性的条带.用该病料接种PK-15细胞,24 h即出现细胞病变,PCR和间接免疫荧光试验结果均证明所分离病毒为PRV.用该PRV分离株接种兔后出现奇痒症状并麻痹致死;接种仔猪后出现持续发热,肌肉震颤等症状.通过对自然感染PRV病死仔猪脏器进行PCR检测,发现PRV在仔猪体内广泛分布,其中以脾的检出率最高,可达100%;对人工感染猪的直肠和鼻腔棉拭样品进行PCR检测,发现病猪排毒最长可达13 d.证实,该分离株为猪伪狂犬病强毒株,脾为病毒检测的首选靶器官.     

甘肃省酒泉地区猪伪狂犬病血清学检测

在甘肃省酒泉地区 15个未经猪伪狂犬病 (PR)疫苗免疫的规模化猪场采血清 2 5 4份 ,经PR斑点酶联免疫吸附试验 (Dot ELISA)检测 ,在 12个猪场检出PR抗体 ,检出阳性血清 48份 ,平均阳性率 18.9%。提示 ,在该地区部分猪场有猪伪狂犬病毒 (PrV)感染     

猪IL-4稳定表达细胞系的建立

为了构建能稳定表达猪白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)的细胞系,本研究对猪IL-4基因进行了克隆,发现该基因开放阅读框(ORF)长402 bp,编码133个氨基酸,分子质量为15.02 ku,PI为8.64。与牛、绵羊、马、猫、狗和人的同源性分别为80.5%、76.7%、72.7%、72.9%、72.0%和69.2%,而与小鼠的同源性仅为41.5%。通过Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切后将p IL-4基因插入含EGFP标签的p IRES2-EGFP载体中,构建出重组质粒p IRES2-EGFP-p IL-4。该重组质粒转染猪肠上皮细胞(IPEC-J2)后,经G418阳性筛选,获得稳定表达猪IL-4的细胞系。p IRES2-EGFP-PIL-4重组质粒转染IPEC-J2细胞后第24小时,荧光定量PCR结果表明,IL-4 m RNA的表达量较对照组及空载体组极显著升高(P0.01),荧光显微镜下亦可见大量绿色荧光表达。该细胞系在连续传代28次以后,仍可见IL-4在基因水平和蛋白水平的高表达。本研究成功构建了真核表达载体p IRES2-EGFP-p IL-4和能稳定表达猪IL-4的细胞系,为进一步研究其功能奠定了基础。     

伪狂犬病弱毒疫苗的研究——接种猪的细胞免疫应答

本文报道了12头130日龄伪狂犬病弱毒疫苗(PRV_(FB))接种杂交猪在2个月内细胞免疫应答的动态变化。其结果:PRV_(FB)致敏的猪外周血淋巴细胞(L.C.)对PHA的应答出现两个峰,分别出现在免疫后的7和21天;而L.C对同源抗原(PRV_(FB))的应答缓慢上升,在第21天形成唯一的峰值,直到90天,其应答能力还显著高于免疫前的水平(P<0.05)。其血清中和抗体指数在免疫后4天就达到1.9(Lg),同样在21天形成峰值,而到60天,其中和指数也显著高于免疫前水平(P<0.01)。显而易见,PRV_(FB)既能刺激机体产生中和抗体,又能产生细胞免疫,并且能够维持相当长的时间。证明PRV_(FB)是一种较好的伪狂犬病弱毒疫苗。     

减毒沙门菌递呈的猪传染性胃肠炎病毒S基因与猪IL-6基因双启动子DNA疫苗的构建

从猪传染性胃肠炎病毒克隆质粒pMD19T-S中扩增了2.1kb的S基因片段(含完整的A、B、C、D 4个抗原位点序列),以RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增了猪白细胞介素6(IL-6)(658bp),插入同一双启动子真核表达载体pVAXD的2个多克隆位点,构建了共表达S与IL-6基因的双启动子表达质粒pVAXD-S-IL-6,转染COS7细胞进行转录和表达鉴定。将质粒pVAXD-S-IL-6电转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,筛选获得重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6),并对重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)的体外稳定性和口服小鼠的安全性进行了鉴定。结果表明该双启动子真核表达质粒pVAXD-S-IL-6构建成功,RT-PCR检测到转染的COS-7细胞中2个目的基因的转录,间接免疫荧光试验结果显示表达产物可与猪抗猪传染性胃肠炎病毒血清发生特异性反应。重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)在含卡那霉素的抗性培养基中稳定性好,以1×109 CFU灌胃接种小鼠具有良好的安全性。本研究构建了猪传染性胃肠炎病毒的新型口服疫苗株SL7207(pVAXD-S-IL-6),为开展其免疫原性评价奠定了基础。     

囊素对猪口蹄疫灭活疫苗的免疫增强作用

用提取的天然囊素(10μg/mL)和O型口蹄疫灭活疫苗协同免疫45日龄仔猪,研究了其对O型口蹄疫灭活疫苗免疫效果及仔猪增重的影响。将32头健康45日龄仔猪随机分为4组,0.5 mL疫苗 囊素免疫2次(Ⅰ)组1、.0 mL疫苗 囊素免疫2次(Ⅱ)组1、.0 mL疫苗 囊素免疫1次(Ⅲ)组和1.0 mL疫苗免疫2次(Ⅳ)组(疫苗对照组),用液相阻断酶联免疫吸附试验(LB-ELISA)检测各组猪免疫前及一免后第14、28、42、60、74、881、02 d的口蹄疫血清抗体效价并称重。结果,Ⅱ组抗体水平显著高于Ⅳ组(P<0.01),Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组间差异不显著(P>0.05);一免后第60~110 d仔猪平均日增重囊素组明显高于对照组(P<0.05)。结果表明,囊素可以提高口蹄疫灭活疫苗的免疫原性,提高猪增重,促进生长发育。     

猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞生物学活性的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康仔猪,在接种后不同时间宰杀,收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照。用FITC-Annexin V/PI双染色流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测PAM凋亡现象,通过EA花环试验测定Fc受体数目,通过吞噬鸡红细胞试验测定吞噬功能,分析PCV2感染对PAM生物学活性的影响。结果显示,在整个试验期内2种方法均没有检测到PAM凋亡,表明PCV2感染不会诱发PAM凋亡。PAM的Fc受体数和吞噬鸡红细胞数的变化规律一致,与对照组相比,两者数量在接种后第3 d明显下降,第7 d有所回升,之后基本恢复,表明PCV2感染后PAM吞噬和清除病原的功能出现短暂下降。     

猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.     

猪伪狂犬病和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊治

广东省某猪场饲养母猪 60 0头 ,1999年 8月份初产母猪所产仔猪 3日龄开始发病 ,病猪以发热、尖叫、抽搐为主要特征 ,7日龄时有的整窝死亡。经确诊为伪狂犬病 (ＰＲ)和猪生殖与呼吸综合征 (ＰＲＲＳ)病毒混合感染。1　发病情况该场建于 1997年 8月 ,同年 9月从深圳某种猪场引进种公猪及后备母猪近 40 0头。 1998年 1月配种 ,生产正常。 1999年2月又从深圳某种猪场引进种公猪及后备母猪 2 0 0余头 ,1999年 4月配种。配种前 3 0ｄ左右按免疫程序分别注射了猪瘟、猪丹毒、猪肺疫、猪链球菌病、猪细小病毒病、日本乙型脑炎和ＰＲ等疫苗 ,其中ＰＲ…     

猪肾虫病的诊断与治疗

20 0 3年春夏间,笔者参加了几次猪病的诊疗,通过临床诊断、治疗效果观察及剖检验证等,最终确诊为猪肾虫病。猪肾虫病是由猪肾虫寄生于猪的肾及其周围脂肪和与输尿管相通的结缔组织的包囊内等处而引起的一种线虫病。猪肾虫又叫有齿冠尾线虫,虫体粗壮、灰褐色,猪只不论大小均可感染,危害较大。患病肥育猪生长迟缓,公猪可失去配种能力,母猪不孕或流产,甚至可造成猪的大批死亡。初期病猪出现皮肤炎症;以后表现为精神欠佳,食欲下降,喜卧,后肢无力,跛行。逐渐贫血,消瘦。检查尿液,如发现虫卵或剖检病猪见肾盂及肾周围脂肪内有虫体,即可确诊。1　诊…     

猪IFN-α1基因的原核表达及其蛋白质结构的预测

利用RT-PCR技术,从被诱导的猪外周血单核细胞中克隆出了猪α1干扰素(IFN-α1)基因.序列分析表明,克隆的猪IFN-α1基因序列与GenBank上登录的猪IFN-α1基因的同源性为97.8%.用克隆的猪IFN-α1基因构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-IFN-α1.探讨了猪IFN-α1.基因表达的最佳条件,并在大肠杆菌中对此基因进行了表达.结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为42℃,诱导9h表达量最大,表达产物约占菌体总蛋白的30%.SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子质量为45 ku,且目的蛋白主要以包涵体的形式存在.经预测,猪IFN-α1蛋白为一结构松散的球状蛋白.     

猪附红细胞体病的诊断与防治

从 2 0 0 2年 8月以来 ,丹东地区发生了一种以高热、发绀、贫血、流产为主要临床症状的猪病 ,其流行面积之大 ,发病猪数之多 ,损失之惨重实属罕见。因多数基层兽医人员对该病认识不清 ,开始被误诊为弓形虫病、钩端螺旋体病、流感、猪瘟、链球菌病、副伤寒等疫病 ,采用青霉素、链霉素、磺胺类药、退热解毒等药物治疗 ,效果均不理想。笔者根据流行病学调查、病理剖检、实验室检查等 ,确诊为猪附红细胞体病。1　流行情况2 0 0 2年 8月 5日 ,在辽宁省东港市菩萨庙镇关海山村首先发现该病 ,接着在宽甸县、凤城市、振安区、振兴区等地的一些乡 (镇…     

猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪动脉血管内皮细胞上的培养特性

探索应用原代猪血管内皮细胞培养猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究PRRSV对血管内皮细胞的损伤及其作用机制建立模型。用Ⅱ型胶原酶灌注60日龄健康仔猪颈总动脉分离获得动脉血管内皮细胞,以PRRSVHuN4株接种原代猪血管内皮细胞,进行细胞形态和荧光定量RT-PCR检测。结果显示,PRRSV接种原代猪血管内皮细胞后,呈现典型的细胞病变,病毒增殖规律与Marc-145细胞基本相同。结果表明,在猪血管内皮细胞上成功复制了PRRSV,为下一步研究PRRSV在血管内皮细胞中的复制及其导致的病理损伤提供了试验依据。     

PCV2感染对猪MCP-1和IL-8 mRNA表达的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康普通仔猪,于接种后不同时间宰杀,收集肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照。用竞争PCR技术测定趋化性细胞因子IL-8和 MCP-1 mRNA水平,分析PCV2感染对其mRNA表达的影响。结果显示,与对照组相比,在 PCV2感染后第7 d,IL-8 mRNA水平下降至最低,随后迅速上升,至第14 d时达到高峰,而后快速下降,但仍维持较高水平;MCP-1 mRNA水平在攻毒后第3 d下降至最低,之后逐渐上升,至第14 d时达到高峰,而后下降,第21 d以后恢复正常。结果表明,PCV2感染初期可导致PAM趋化性细胞因子IL-8和MCP-1基因的转录明显下调。     

PRRSV和PCV-2以及PRV多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法.敏感性试验结果显示,PRRSV、PCV-2的敏感性可达250拷贝/μL,PRV的敏感性可达500拷贝/μL.表明,该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可以用于PRRSV、PCV-2和PRV的快速检测.     

猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三重PCR检测方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2、猪伪狂犬病病毒(PRV)gD和猪细小病毒(PPV)VP2基因保守区域,设计了特异性引物,在分别建立单一病毒基因PCR检测方法的基础上,通过对3组引物的比例和浓度、dNTPs和Mg2 浓度、退火温度等条件的优化,建立了针对上述3种病毒的三重PCR检测方法。敏感性试验表明,应用该方法最低可检测到4×10-4ng/μL的PRV双链DNA模板和2×10-5ng/μL的PCV2和PPV单链DNA模板。对21份自然感染病猪样品的检测结果表明,该三重PCR检测结果与单一PCR检测的结果完全符合。试验结果显示,建立的三重PCR方法可用于3种DNA病毒的同时检测,具有快速、准确的特点,有临床应用前景。