耐氟喹诺酮类病原菌gyrA基因突变的寡核苷酸芯片检测

根据大肠杆菌、沙门菌、无乳链球菌和鸡毒霉形体的gyrA基因序列,设计了通用引物和11条寡核苷酸探针;利用点样仪将探针点在基片上,制成寡核苷酸芯片;采用PCR荧光标记靶基因,与芯片杂交,用荧光扫描仪检测信号;同时以PCR-测序法进行gyrA基因突变的检测。结果,PCR反应体系能特异性地扩增出靶基因;寡核苷酸芯片能同时检测不同病原菌GyrA第83、87位发生的突变,芯片检测结果与测序结果较为一致。结果表明,使用寡核苷酸芯片技术检测病原菌耐氟喹诺酮类基因突变是可行的;研究结果为基因芯片技术应用于兽医临床耐药性检测提供了基础。     

检测987p+肠毒素性大肠埃希氏菌PCR方法的建立

以 98 7p菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了 1对可扩增 45 9bp目的片段的引物 ,建立了检测肠毒素性大肠埃希氏菌 987p菌毛基因的PCR方法。该方法对K 88 ( 为菌毛阳性 )、K 99 、F 41 参考菌株和链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的检测结果均为阴性 ;该方法的敏感度可达 10 2 CFU ,对 2 0株腹泻仔猪粪便分离物进行检测 ,有 1株为阳性 ,与血清学检测的结果一致。结果表明 ,此方法特异性和敏感性都很高 ,可用于临床 987p肠毒素性大肠埃希氏菌病的快速诊断和流行病学调查     

利用16 S rDNA序列对两种芽孢杆菌的鉴定

根据不同种属细菌的16 S rDNA序列两端的保守性区域设计通用引物,提取菌株的基因组DNA,对菌株的16 S rDNA进行了PCR扩增,对扩增到的目标片段进行了测序,将测序结果与NCBI上已知菌种的16 S rDNA序列进行了BLAST对比,并构建了系统进化树.结合传统的形态观察及生理生化特性鉴定,16 S rDNA序列分析结果证实芽孢杆菌Pab02为枯草芽孢杆菌,PAS38为蜡样芽孢杆菌.     

利用aroA基因建立鸡传染性鼻炎PCR诊断方法

利用aroA基因设计了1对引物,分别对10株标准副鸡嗜血杆菌(HPG)菌株、14株分离的HPG菌株进行PCR扩增,结果均得到了与预期大小一致的片段,而对10株非HPG菌株和3株病毒进行扩增则无相应片段产生;该PCR能检测出10个菌细胞.与常规PCR方法相比,aroA-PCR的敏感性更高.     

五种重要致病性弧菌高通量液相芯片检测方法的建立

为建立一种快速、准确同时检测5种致病性弧菌的高通量液相芯片技术,本研究针对霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌的10个目的基因,包括5个种特异性基因和5个毒力基因,分别设计特异性引物和探针,多重PCR扩增后的产物与偶联有不同核酸探针的微球混合物进行杂交反应,利用液相芯片检测仪分析结果。结果显示,本方法同时检测这5种致病性弧菌时,检出限最高达到1.8×10~2 CFU/mL;检测包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、河流弧菌、沙门菌、李斯特杆菌和铜绿杆菌等常见细菌时,均无交叉反应,表明特异性好;检测不同批次的样品时,变异系数均小于8%,表明重复性良好。本研究建立的液相芯片检测方法能够快速同时检测这5种致病性弧菌,具有高通量、灵敏性高、重复性好、可控性强、节省样本和时间等优点,对水产品中多种重要致病性弧菌的检测和流行病学调查提供了技术支持。     

iss基因与鸡大肠杆菌致病力的关系

为探讨iss基因的存在及其核苷酸序列的差异与鸡大肠杆菌致病力的关系,分别采用普通PCR及套式PCR方法检测iss基因在21株鸡大肠杆菌菌株中的分布,并进行序列测定,分析菌株携带iss基因的情况及不同毒力的菌株间iss基因序列的差异。结果显示,经套式PCR检测21株鸡大肠杆菌均携带iss基因,而普通PCR检测显示仅有13株携带iss基因;16株菌株iss基因与国外禽大肠杆菌iss基因参考序列同源性为100%;其余5株中,E1与参考序列同源性为93.5%,E33、O78与参考序列同源性为99.4%,E4、E21与参考序列同源性为99.7%。推测,iss基因可能在不同来源、不同毒力、不同血清型的鸡大肠杆菌中都普遍存在,仅是拷贝数高低不同,而不是目前普遍认为的"有或无"的关系,并且iss基因序列是高度保守的。iss基因与鸡大肠杆菌致病力的相关性可能与它所定位的质粒拷贝数有关,与iss基因的序列差异无关。     

猪四种呼吸道病原菌四重PCR检测方法的建立与应用

为建立可同时快速检测猪支气管败血波氏杆菌(Bb)、副猪嗜血杆菌(Hps)、胸膜肺炎放线杆菌(App)和多杀性巴氏杆菌(Pm)的四重PCR方法,根据Bb的fla基因、Hps的16S rRNA基因、App的apxⅣ基因和Pm的特异性基因KMT1设计4对特异性引物,基于TaKaRa公司的Premix Taq PCR预混酶,对四重PCR的引物浓度和退火温度进行优化,确定该四重PCR的反应体系和反应条件,通过对特异性及同一种病原菌不同血清型检测的通用性、敏感性和重复性评价,建立快速检测猪这4种呼吸道病原菌的四重PCR方法,同时应用该方法对81份临床样本进行检测,检测结果与这4种病原菌单项PCR检测以及4种病原菌的分离鉴定结果进行比较。结果表明,该方法能同时对这4种病原菌进行检测,特异性和通用性好、重复性好,对这4种病原菌DNA的最低检测质量浓度为20 pg/L,对这4种细菌的最低检出量分别为1×10~3CFU/mL的Pm,1×10~2CFU/mL的Hps、Bb和App,敏感性高。81份临床样本的四重PCR检测结果和单项PCR检测结果一致,PCR检出率明显高于细菌分离鉴定结果。本研究成功建立了可同时检出猪支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的四重PCR方法,该方法可用于临床样本的快速检测以及这4种病原菌的鉴别检测。     

四种血清型胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立

根据胸膜肺炎放线杆菌(APP)外膜蛋白OmlA序列设计种特异性引物,根据血清型1、2、6、7荚膜多糖(CPS)序列分别设计型特异性引物,通过优化PCR扩增条件,分别扩增出OmlA(952 bp)、CPS1(630bp)、CPS2(504 bp)、CPS6(720 bp)、CPS7(389 bp)特异性片段,建立了既可对APP进行定性检测又可对APP 1、2、6、7进行定型检测的多重PCR.特异性试验表明,此多重PCR能从APP 1～4、6～10标准株中扩增出与引物相应的特异性片段;对猪副嗜血杆菌、猪肺炎霉形体、多杀性巴氏杆菌、肠炎沙门菌、猪链球菌、大肠杆菌和猪丹毒杆菌进行扩增,均未扩增出片段.敏感性试验表明,此多重PCR能够检测到DNA的量为10 pg.45头疑似病猪病料的细菌分离鉴定结果与此多重PCR的鉴定结果一致.上述结果表明,建立的多重PCR适合于APP 1、2、6、7的鉴别诊断及流行病学调查.     

进口鱼粉和肉骨粉病原性沙门菌的分离鉴定及其16S rRNA序列的同源性分析

从进口的 17批饲料用鱼粉、肉骨粉样品中分离得到 4株细菌 ,采用生化和血清学方法鉴定 ,提取其DNA ,用细菌 16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增 ,并对PCR扩增产物测序 ,将测定的 16SrRNA序列在NCBI数据库中进行序列同源性比较 ,确证为沙门菌 ,其中样品 2、8与鼠伤寒沙门菌的序列同源性大于 99% ,样品 10、11与伤寒沙门菌的序列同源性大于 99%。由此可以认定样品 2、8为鼠伤寒沙门菌 ,样品 10、11为伤寒沙门菌     

牦牛肠道与粪便乳酸菌的分离鉴定及PCR-16 S rDNA鉴定

以取自四川省不同地区的牦牛粪便、肠道内容物为材料,用MRS琼脂双层培养基进行厌氧培养,分离到50株乳酸菌,经生化鉴定为嗜热链球菌(2株)、乳酸乳球菌(1株)、保加利亚乳杆菌(5株)、嗜粪乳杆菌(10株)、嗜酸乳杆菌(8株)、乳酸乳杆菌(9株)、肠乳杆菌(10株)、弯曲乳杆菌(5株)。采用乳酸菌16 S rDNA通用引物,对分离的8种菌的16 S rDNA一段可变区序列进行扩增,均得到大小约470 bp的产物;扩增产物经纯化、测序后与GenBank中标准菌株的核甘酸序列比较,同源性均大于97．5％,同源性分析与生化试验的结果是一致的。证实,牦牛肠道和粪便的乳酸菌较为丰富,且乳杆菌的数量较多,这可能与牦牛复杂的生长环境有关。     

湖南省华支睾吸虫线粒体cox1和nad1基因的克隆及进化分析

为了研究湖南省华支睾吸虫分离株线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位Ⅰ基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pcox1和pnad1序列构建华支睾吸虫与其他吸虫的种群遗传进化树。应用聚合酶链反应扩增华支睾吸虫虫株的pcox1和pnad1,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,然后用Phylip3.67程序中的MP法和MEGA4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树。结果显示,所获得的pcox1和pnad1序列长度分别为1 100bp和790bp,种系发育进化表分析表明,25个华支睾吸虫分离株位于同一分枝。证实华支睾吸虫pcox1和pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记,从而为华支睾吸虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定基础。     

广东首株犬源贾第虫的基因型鉴定

为了对广东首株犬源贾第虫进行分离鉴定,采用常规方法分离犬粪便中的贾第虫包囊,通过显微镜观察对其进行形态学鉴定,并以小亚基核糖体RNA(16SrRNA)基因和谷氨酸脱氢酶(gdh)基因作为遗传标记,采用PCR方法对其进行了扩增、克隆、序列测定和分析。将扩增序列与GenBank中登录的参考序列进行比对,并用DNAStar软件建立系统进化树,以确定该贾第虫的基因型。结果显示,显微镜观察的结果与所报道的蓝氏贾第虫的形态一致;PCR扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测,出现299和432bp的片段,与预期结果一致;16SrRNA基因的序列分析结果显示该犬源贾第虫的基因型为A型,对gdh基因序列的进一步分析显示该基因型为A1亚型。结果表明本次分离的犬源贾第虫属于蓝氏贾第虫人兽共患的基因型。关键词:犬;蓝氏贾第虫;基因型     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型抑制消减杂交文库的构建和分析

为了研究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)不同血清型之间的差异表达基因,采用抑制消减杂交(SSH)法,以APP血清7型DNA作为测试方(Tester)、APP血清1型DNA作为驱动方(Driver),进行2轮杂交和2轮选择PCR扩增,将PCR扩增产物连接pMD18-T载体,筛选阳性克隆后进行测序和序列比对。结果显示,15个阳性克隆中的13个为已知序列,其同源性为88%~100%,2个为未知序列,其结构和功能还需进一步研究。首次构建了APP7的抑制消减杂交文库,为APP感染和致病机制的研究奠定了基础。     

鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析

采用抑制性消减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析。结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段。经同源分析,这些序列可分为3类:噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列。这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素I、paJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因。结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株基因组间存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础。     

利用PCR检测鸭瘟病毒

参照文献 ,设计和合成了 1对引物。用这对引物 ,以标准毒株DPVF3 4的DNA为模板 ,经PCR扩增出 1个特异的DNA片段。经序列测定 ,该DNA片段由 42 0bp组成。与文献报道的序列比较 ,该片段为鸭瘟病毒UL6基因DNA的一部分 ,与美国毒株LakeAndes(LA)的同源性达 99%。用该PCR方法扩增小鹅瘟病毒、细小病毒和禽巴氏杆菌 ,结果为阴性。以该PCR方法检测 6份送检病料 ,5份为阳性 ,检出率与病毒的分离一致。另外 ,该方法检测DPVDNA的敏感性达到了 1pg水平     

芽胞杆菌的分离鉴定

为了确定实验室筛选的6株芽胞杆菌(Bacillus spp.)的种名,利用形态学、DNA促旋酶A亚单位基因(DNA Gyrase Subunit A,gyr A)和DNA促旋酶B亚单位基因(DNA Gyrase Subunit B,gyr B)序列的单基因系统发育分析和PCR相结合的方法进行鉴定。结果表明,6株芽胞杆菌的单菌落生长特征相似,革兰染色呈阳性,具有芽胞;以gyr A和gyr B基因构建的单基因系统发育树显示6株菌均与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)归于同一分支,自展值(Bootstrap)较高;特异性PCR结果也证实它们均为贝莱斯芽胞杆菌阳性。结论,实验室分离的6株芽胞杆菌均属于贝莱斯芽胞杆菌,这为它们的深入研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒北京分离株的ORF7克隆与序列分析

将北京地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ） 分离株ＢＪ２ 和ＢＪ４ 的ＯＲＦ ７ 及部分３’端非编码区（ ＵＴＲ） 的ＲＴＰＣＲ 扩增产物克隆连接于ｐ ＧＥＭＴｅａｓｙ 质粒载体上,重组质粒经ＥｃｏＲ Ⅰ酶切鉴定后进行了双链测序。测定的基因序列与欧美标准毒株已知序列比较发现,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与美洲ＶＲ２３３２ 株非常接近,在其长度为５５５ ｂｐ 的ｃＤＮＡ 序列中,仅与ＶＲ２３３２ 株分别相差１ 和２ 个核苷酸,其中ＯＲＦ ７ 的核苷酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别高达１００ ％ 和９９ ．４６ ％ ,其推导的氨基酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别为１００ ％ 和９９ ．２５ ％ ,３’ＵＴＲ 则完全相同;而与欧洲ＬＶ 株则有明显差异,其核苷酸序列同源性仅为６８ ．００ ％ 和６７ ．００ ％ ,推测的氨基酸序列同源性仅有６５ ．００ ％ 和６４ ．００ ％ ,且ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与ＬＶ 株相比缺失了ＫＫＳＴＡＰＭ 和ＡＳＱＧ 两段氨基酸序列,而３’ＵＴＲ 则比ＬＶ 株多出３８ ｎｔ 的一段特征性核苷酸序列。序列分析结果表明,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株属于同一基因型,且具有ＶＲ２３３２ 株的基因特点     

传染性腔上囊病病毒VP3蛋白模拟表位的筛选

为了研究传染性腔上囊病病毒(IBDV)的致病机理及研制有效的IBDV疫苗,利用噬菌体展示技术对IBDV VP3抗原表位进行了筛选。以4株IBDV VP3单克隆抗体HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E作为筛选分子,对噬菌体随机15肽库进行3轮吸附-洗脱-扩增淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取20个单克隆噬菌斑,通过间接ELISA和竞争抑制ELISA检测,共选出13个单克隆噬菌斑,经噬菌体gⅢ部分基因的核苷酸序列测定,确定了8个15肽为IBDV抗原表位。这8个15肽在一级结构上没有3个以上连续氨基酸与IBDV Gx(Gen-Bank登录号:AY444873)VP3的氨基酸序列相同,但二级结构上均以β折叠为主,并且与单抗的结合可被VP3蛋白有效地抑制。证实,筛选的是IBDV VP3的模拟表位。     

大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位基因的克隆与鉴定

根据已发表的大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位 (FedF/ab)的基因 (fedF/ab)序列 ,设计了 1对引物 ,利用PCR技术从大肠埃希氏菌F10 7/ 86、YCED1、YCED2、C、D和 12F株中分别扩增获得了一段序列 ,并克隆至 pGEM T载体 ,获得了重组质粒TF10 7F、TYCED1F、TYCED2F、TCF、TDF、T12FF。经琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析 ,6个重组质粒的大小均为 90 3bp ,与fedF/ab基因大小一致。其中大肠埃希氏菌F10 7/ 86、YCED1、C和 12F株的fedF基因序列完全相同 ;只有YCED2株在第 181位碱基处存在 1个C→T的无义变异差异 ,D株在第 6 5 5位碱基处存在 1个T→C变异差异并在氨基酸水平出现 1个S→P变异。结果表明 ,所克隆的序列均为F18ab菌毛F亚单位的基因     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了ORF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中,筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB-ORF2。对质粒中的插入片段测序后,应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果,3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100%;它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高,达99.5%。