猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白基因的克隆及序列分析

以国内主要流行的猪胸膜肺炎放线杆菌 (APP)QH 1、HN 7菌株的基因组DNA为模板 ,通过PCR方法扩增出外膜脂蛋白 (OML)基因片段 ,然后将其克隆至 pMD18 T载体中 ,经酶切和PCR鉴定 ,对阳性克隆进行序列测定。将测序结果分别与标准菌株进行比较 ,QH 1株的核苷酸序列与血清 1、9、11、12型参考株的同源性达 99.1%～ 99.9% ;HN 7株的核苷酸序列与血清 7、3、4、6型参考株的同源性达 97.3%～ 10 0 % ,与其他血清型参考株的同源性较低。     

胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及序列测定

用PCR法从胸膜肺炎放线杆菌 (APP) 7型的DNA提取物中扩增出大小为 2 873bp的APXⅡA基因片段 ;将PCR产物重组到质粒载体 pMD 18 T中 ,并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明 ,克隆片段为完整的目的基因 ,该片段的核苷酸序列与国外分离株M 30 6 0 2的同源性达 99.7%。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清7型25-4株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜蛋白(OMP)基因特异片段,并克隆于pMD 18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1,成功构建了重组表达载体pGEX-omp;以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),经SDS-PAGE鉴定,表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku,命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解,获得切掉标签的OMP。经ELISA检测,该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应,具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APPOMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。     

四种血清型胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立

根据胸膜肺炎放线杆菌(APP)外膜蛋白OmlA序列设计种特异性引物,根据血清型1、2、6、7荚膜多糖(CPS)序列分别设计型特异性引物,通过优化PCR扩增条件,分别扩增出OmlA(952 bp)、CPS1(630bp)、CPS2(504 bp)、CPS6(720 bp)、CPS7(389 bp)特异性片段,建立了既可对APP进行定性检测又可对APP 1、2、6、7进行定型检测的多重PCR.特异性试验表明,此多重PCR能从APP 1～4、6～10标准株中扩增出与引物相应的特异性片段;对猪副嗜血杆菌、猪肺炎霉形体、多杀性巴氏杆菌、肠炎沙门菌、猪链球菌、大肠杆菌和猪丹毒杆菌进行扩增,均未扩增出片段.敏感性试验表明,此多重PCR能够检测到DNA的量为10 pg.45头疑似病猪病料的细菌分离鉴定结果与此多重PCR的鉴定结果一致.上述结果表明,建立的多重PCR适合于APP 1、2、6、7的鉴别诊断及流行病学调查.     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型标准菌株基因组为模板,用PCR扩增ApxⅠBD基因的特异性片段;对PCR产物纯化回收后与载体pMD 18-T进行连接、转化,经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pETⅠBD;转入大肠埃希氏菌BL21中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳。结果,从APP中克隆的ApxⅠBD DNA序列与已发表序列的同源性为100%,长1 447 bp,编码482个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku,与预期的大小相符。结果表明,含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

刚地弓形虫强弱毒株速殖子抑制消减cDNA文库的构建和初步分析

为筛选刚地弓形虫的毒力相关基因,以弓形虫为研究对象,构建了弓形虫强弱毒株抑制消减Cdna文库.分别收集弓形虫Ⅰ型RH株和Ⅱ型QHO株速殖子,提取总RNA,纯化后获得mRNA,并反转录为cDNA,用抑制消减杂交技术(SSH)构建弓形虫强弱毒株正向消减(弱毒株消减强毒株)及反向消减(强毒株消减弱毒株)cDNA文库.从两文库中各筛选10个阳性克隆测序及进行在线BIAST分析.结果显示,构建的弓形虫强弱毒株的消减cDNA文库具有较强的特异性;在获得的18个有效表达序列标签中,有12个与已报道的基因有较高相似性,另外6个可能代表新基因.表明,弓形虫强弱毒株差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究弓形虫毒力相关基因的功能奠定了基础.     

胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因的筛选

利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌(APP)体内表达的基因进行了初步筛选.将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合,分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21(DE3)的全菌及全菌裂解物进行吸附,用ELISA方法检测吸附效果,经吸附后血清D450nm分别由原来的0.927和0.239降低为0.196和0.078.同时,将APP1基因组DNA以Bsp143 Ⅰ进行酶切,回收500～2000 bp的片段,与pET30a/b/c载体连接,构建了APP1基因组质粒表达文库,库容量(CFU)为2.0×105.用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交筛选该基因组表达文库,从3 000个菌落中获得了12个阳性克隆.     

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列表达载体的构建及其转录水平的检测

构建猪肌生成抑制素 (MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体 ,并对mRNA进行转录水平的检测 ,为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后 ,用PCR扩增的 1.2kb目的片段与 pMD18 T载体连接 ,将克隆载体的质粒DNA与同样用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶酶解的表达载体 pET2 8a(+ )质粒定向连接 ,对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录 ,对mRNANorthern杂交进行转录水平的检测。结果 ,所得到的序列与所设计的序列完全一致 ,表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选 ;目的片段定向插入 ,阅读框架正确 ;RT PCR成功地反转录得到约 1.2kb的目的DNA片段 ,Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影 ,见到清晰的 1.2kb特异带     

猪胸膜肺炎放线杆菌半套式PCR检测方法的建立及应用

根据1型胸膜肺炎放线杆菌apx Ⅳ A基因3'端序列设计3条引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的半套式PCR方法.筛选了该方法的最佳反应条件,并采用该方法进行临诊检测,比较了不同处理临床样品的检测结果.结果表明,该方法能检测出所有供试血清型APP,不能从猪上呼吸道常见细菌基因组DNA中扩增出条带,特异性好;最低DNA检出量为16.5 fg,其灵敏性是常规PCR方法的1 000倍;重复性试验结果表明,该方法稳定可靠.应用半套式PCR方法检测临床样品,检出率显著高于细菌分离鉴定;样品保存方法和核酸抽提方法能影响阳性样品的检出率.     

与猪圆环病毒2型基因组茎环结构相互作用的宿主细胞蛋白的筛选

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库,将总cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化酵母诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建,以药物筛选阳性克隆;通过酵母菌落PCR得到阳性克隆中的cDNA插入片段,通过序列分析对此予以确认。本试验成功地构建了酵母单杂交文库,筛选出1.01×106个酵母克隆,其中196个为阳性克隆。经PCR产物测序,并通过NCBI Blast法进行序列比对,确定有4种蛋白可与PCV2基因组茎环序列发生作用。本研究从宿主细胞cDNA文库中筛选到4种可与PCV2基因组茎环序列发生作用的蛋白,为下一步阐明这些宿主蛋白对PCV2复制的调节作用奠定了基础。     

鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析

采用抑制性消减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析。结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段。经同源分析,这些序列可分为3类:噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列。这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素I、paJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因。结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株基因组间存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础。     

副鸡嗜血杆菌基因文库的构建与筛选

为了筛选副鸡嗜血杆菌的体内表达基因,提取了副鸡嗜血杆菌的全基因组,构建了副鸡嗜血杆菌基因组的pET系统表达文库。运用PCR及核酸内切酶(SalⅠ+NdeⅠ)鉴定基因文库,并以病原菌吸附后的康复血清作为探针,采用菌落原位杂交的方法对基因文库进行筛选。结果显示,重组质粒中有0.5～2kb的片段插入,99%的基因包含在基因文库中;重复筛选后得到的阳性克隆再经过PCR与SalⅠ+NdeⅠ酶切鉴定后定向测序,并对测序结果在NCBI上进行分析后发现筛选获得的基因中,有1个表达为转运谷氨酰还原酶、1个表达为转录终止因子,1个表达为荚膜合成域2,还有2个表达为保守假想蛋白。结果表明,本研究应用体内诱导抗原技术(IVIAT)筛选到了一些副鸡嗜血杆菌体内诱导表达基因,并对基因的功能做了初步探讨,在找寻副鸡嗜血杆菌在体内生存以及致病关键基因的道路上前进了一步,为传染性鼻炎的预防和治疗积累了有价值的资料。     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了ORF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中,筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB-ORF2。对质粒中的插入片段测序后,应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果,3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100%;它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高,达99.5%。     

炭疽杆菌基因检测技术的研究进展

从炭疽杆菌基因组组成、炭疽杆菌基因组的特征及其在基因检测中的应用几方面阐述了炭疽杆菌基因检测技术的研究进展,探讨了分别位于pXO1和pXO2质粒上的主要致病毒素编码基因pagAl、ef、cya和参与荚膜合成的主要蛋白编码基因capA、capB和capC的作用,认为这些炭疽杆菌特异基因序列是建立基因检测体系的可靠基础,其标志性序列有早期发现的序列指纹图谱、高度保守基因序列和最新发现的高度特异基因序列,基因检测方法从早期的RFLP、VNTR、单重PCR、多重PCR发展到最新的实时定量PCR,随着标志性序列特异性的增加和检测方法的改进,炭疽杆菌的诊断工作变得更加准确和快捷。     

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒D971毒株S1基因的序列测定与分析

采用RT PCR方法扩增了鸡传染性支气管炎病毒D971毒株预期的 163 6bp的S1全基因DNA片段 ;以Sanger’s双脱氧末端终止法测定出其核苷酸序列 ,推导出了氨基酸序列 ,并用有关软件构建了S1基因进化树。结果表明 ,IBV D971毒株与国内外AF14 0 3 5 2 (山东农业大学 )、AF15 4841(山东农业大学 )、AF193 43 2 (青岛动物检疫所 )、AY0 43 3 12 (中国农业大学 )、AF3 975 2 8(四川农业大学 )、AY0 43 2 2 1(浙江农业大学 )、AF3 5 2 3 12 (浙江农业大学 )、U2 95 2 2 (澳大利亚 )和M2 1883 (英国 )毒株的核苷酸同源性分别为 99%、99%、95 %、94%、87%、86%、88%、82 %和 80 % ,氨基酸序列同源性依次分别为 93 %、93 %、87%、86%、83 %、83 %、82 %和 80 %。     

MDCK细胞感染犬细小病毒后的差异表达谱分析

通过了解MDCK细胞感染犬细小病毒(CPV)后基因表达水平的差异,研究病毒对细胞的致病作用以及细胞抵御病毒感染的机制。利用表达谱基因芯片技术,分析持续感染犬细小病毒的MDCK细胞基因表达水平的变化情况,并用Real-Time PCR技术加以验证。结果显示,获得了359个差异大于1.5倍的表达基因(P0.05),占总基因数的1.53%,其中193个上调表达(0.84%),166个下调表达(0.69%)。对差异基因进行GO功能聚类分析,小部分涉及免疫应答、生长周期调控、信号转导和蛋白酶活性,其他大部分基因功能未知。利用Real-Time PCR随机验证5个基因在持续感染CPV后的差异表达,其结果和芯片杂交的结果一致。表明建立了MDCK细胞持续感染CPV后的差异表达谱,初步了解到CPV对宿主细胞的制约作用,引起部分细胞增殖调控相关基因发生了表达下调,以及细胞对感染的积极应答反应,部分免疫反应基因、肽链内切酶活性基因等发生了上调表达,从而为探索病毒的致病机理和宿主的抗病毒途径提供了试验基础。     

利用PCR检测鸭瘟病毒

参照文献 ,设计和合成了 1对引物。用这对引物 ,以标准毒株DPVF3 4的DNA为模板 ,经PCR扩增出 1个特异的DNA片段。经序列测定 ,该DNA片段由 42 0bp组成。与文献报道的序列比较 ,该片段为鸭瘟病毒UL6基因DNA的一部分 ,与美国毒株LakeAndes(LA)的同源性达 99%。用该PCR方法扩增小鹅瘟病毒、细小病毒和禽巴氏杆菌 ,结果为阴性。以该PCR方法检测 6份送检病料 ,5份为阳性 ,检出率与病毒的分离一致。另外 ,该方法检测DPVDNA的敏感性达到了 1pg水平     

耐氟喹诺酮类病原菌gyrA基因突变的寡核苷酸芯片检测

根据大肠杆菌、沙门菌、无乳链球菌和鸡毒霉形体的gyrA基因序列,设计了通用引物和11条寡核苷酸探针;利用点样仪将探针点在基片上,制成寡核苷酸芯片;采用PCR荧光标记靶基因,与芯片杂交,用荧光扫描仪检测信号;同时以PCR-测序法进行gyrA基因突变的检测。结果,PCR反应体系能特异性地扩增出靶基因;寡核苷酸芯片能同时检测不同病原菌GyrA第83、87位发生的突变,芯片检测结果与测序结果较为一致。结果表明,使用寡核苷酸芯片技术检测病原菌耐氟喹诺酮类基因突变是可行的;研究结果为基因芯片技术应用于兽医临床耐药性检测提供了基础。