鸡IFN-α和IFN-β及IFN-γ基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上鸡α-、β-、γ-干扰素(ChIFN-α、-β、-γ)基因的序列,在保守区设计并合成各自特异引物,并以鸡3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参,采用SYBR Green Ⅰ染料以建立实时荧光定量PCR检测方法.将IFN-α、-β、-γ基因克隆至pGEM-T载体上,以各阳性质粒作为标准品,构建标准曲线,并进行了熔解曲线分析.结果表明,鸡IFN-α、-β、-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×102～1×108copies/μL范围分别呈良好的线性关系,r2均大于0.990.熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4 h.建立的鸡IFN～α、-β、-γ基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短,为在mRNA水平对鸡IFN的定量分析奠定了基础.     

牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,扩增基因片段长约171 bp,符合目的基因大小,经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的最低检测量为53.3 copies/uL。用该方法检测牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和猪细小病毒,结果显示,只有牛细小病毒可以被检测到,而其他病毒均未被检出,表明该方法具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。结果表明,本研究建立的基于NS1基因的牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性,可用于牛细小病毒感染的检测。     

猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoV M基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×10~8～6.57×10~1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%;灵敏度可达6.57×10~1copies/μL;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0%。上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断。     

痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×10^9~7.58×10^2copies/μL范围内呈良好线性关系,R^2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性。临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高。结果表明,建立的痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段。     

坦布苏病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR,针对坦布苏病毒E基因设计1对特异性引物,用PCR扩增E基因后将其连接到pMD19-T载体上构建重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板绘制了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,经反应条件优化后,绘制的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR的标准曲线的线性关系显著(r20.999),平均试验间变异系数为0.26%;检测敏感性可达到2×101 copies/μL。应用该方法对人工感染坦布苏病毒的鸭组织进行的检测结果显示,从36份病料组织中检出35份为阳性,检出率为97%。结果表明,成功建立了检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR,该方法较常规PCR更快捷、敏感、准确,适用于坦布苏病毒临床样品的检测。     

家兔皮肤真菌双重SYBR GreenⅠ定量PCR检测方法的建立

为建立家兔皮肤真菌快速检测方法,根据GenBank相关基因,分别设计皮肤真菌和须癣毛癣菌这2对特异引物,建立了皮肤真菌和须癣毛癣菌双重SYBR GreenⅠ定量PCR方法。结果显示,在熔解温度86~86.5℃和88.5~89℃分别出现皮肤真菌和须癣毛癣菌特异波峰,且与其他真菌没有交叉反应;重复试验变异系数为0~0.32%;最低检测浓度为3.3×10/mL;分离菌株样本与病料样本双重SYBR GreenⅠ定量PCR检测结果一致。结果表明,本试验建立的双重SYBR GreenⅠ定量PCR方法特异、稳定、敏感,可以用于临床样品的检测。     

鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10~2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10~4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为103.0%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测63copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对65份临床样品的检出率高于常规PCR。结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测TGEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于TGEV的定量检测和猪传染性胃肠炎的早期快速诊断。     

鸡IL-1β和IL-2及IL-6基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立检测鸡IL-1β、IL-2及IL-6基因的荧光定量PCR方法,根据GenBank上IL-1β、IL-2、IL-6的基因序列,在保守区设计并合成了各自的特异引物,选择β-actin和GAPDH基因为内参,采用SYBRGreen Ⅰ染料法,以常规PCR产物为标准品,建立标准曲线,并进行熔解曲线分析.结果显示,各基因标准曲线的C_1值检测范围在12～33左右,具有良好的线性关系,r~2均大于0.990.熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰.结果表明,建立的鸡IL-1β、IL-2及IL-6基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,为从mRNA水平对鸡IL进行定量分析奠定了基础.     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为开发一种快速、准确、灵敏及定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对PEDV S基因的特异性引物,建立以SYBR GreenⅠ为染料的荧光定量RT-PCR检测方法,对疑似PEDV感染的临床样品进行检测并与普通RT-PCR结果进行比较。结果显示,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R~2=1,其扩增效率E=2.03,熔解曲线为尖锐单峰;不与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪丁型冠状病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,具有较强的特异性;最低检出浓度(1×10~1copies/μL)比普通RT-PCR方法灵敏100倍;批内批间重复性试验的变异系数均小于2%,重复性和稳定性好;将36份临床样品检测结果进行比较,与普通RT-PCR的总符合率为88.89%。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏度高,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。     

增免散对鸡脾T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群的影响

将300只1日龄雏鸡随机分为中药增免散组、环磷酰胺组、环磷酰胺 左旋咪唑组、环磷酰胺 增免散组和正常对照组,6日龄时用鸡新城疫LaSota疫苗点眼滴鼻免疫,14、21、28、35日龄时测定鸡血液NDV抗体效价,脾器官指数,脾组织中CD4 、CD8 T淋巴细胞浓度和脾细胞凋亡率,观察脾的组织结构变化。结果显示,14、21日龄增免散组抗体水平高于其他各组(P<0.01);14、21、28日龄增免散组脾指数高于其他各组,增免散组脾CD4 细胞浓度、CD4 /CD8 比例高于其他各组,差异极显著(P<0.01);14、21、28日龄增免散组脾细胞凋亡率低于其他各组,差异极显著(P<0.01);14、21日龄时,增免散组脾白髓和红髓内网状细胞和中淋巴细胞较多,脾小体比对照组略有增加。表明,中药增免散不仅能促进鸡脾的发育,增高脾组织中CD4 /CD8 比例,而且对环磷酰胺的免疫抑制有一定拮抗作用。     

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86 mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康大白仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)共刺激分子CD80-CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明,在感染后第3 d和第7 d CD80与CD86 mRNA转录显著下调(P<0.05),感染后第14 d CD86 mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80 mRNA转录水平在第14 d和第28 d高于对照组,CD86 mRNA转录水平在第28 d高于对照组,两者在第42 d均高于对照组,但无显著差异。证实,PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PAM的抗原呈递能力受到影响。     

牛CD14结构基因的PCR扩增及序列分析

在用牛肺巨噬细胞构建了ｃＤＮＡ基因文库的基础上，参照人和小白鼠ＣＤ１４的基因序列设计一对引物，用ＰＣＲ方法成功地扩增出编码牛ＣＤ１４的特异性ＤＮＡ片段，并进行了序列分析。结果表明，牛ＣＤ１４基因的核苷酸在相同区域内与人ＣＤ１４的同源性为７９％，推导氨基酸序列的同源性为７３％；而与小白鼠的核苷酸和氨基酸的同源性分别为７５％和７１％。无论在核苷酸还是氨基酸水平上，牛ＣＤ１４基因与人ＣＤ１４的同源性都要高于与小白鼠的同源性。     

非洲猪瘟CD2v胞外区基因片段的真核表达及其多克隆抗体的制备

本研究利用真核表达系统表达非洲猪瘟病毒的CD2v胞外区蛋白,研究其免疫特性,制备多克隆抗体并研究其性质,为研发特异性单抗奠定数据基础。以非洲猪瘟病毒Wuhan2019-1株(GenBank:MN393476.1)为模板,合成CD2v胞外区基因序列,并将其克隆至真核表达载体pCAGGS载体中,获得pCAGGS-CD2v胞外区重组质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染293F细胞,获得重组胞外CD2v蛋白(简称His-CD2v)。用Ni-NTA柱纯化His-CD2v,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用ELISA和间接免疫荧光对多克隆抗体进行鉴定。结果显示,(1)His-CD2v融合蛋白在293F中以可溶形式表达,SDS结果显示,相对分子质量约为35~80 ku的弥散带;(2)融合表达的His-CD2v能与阳性血清反应,与对照不反应;(3)HisCD2v制备的多抗效价最高达1∶218700,且能与阳性血清竞争性结合CD2v抗原。上述结果表明,His-CD2v融合蛋白的表达及其多抗的成功制备,为进一步筛选CD2v特异性单抗及研制竞争ELISA试剂盒,为非洲猪瘟感染与免疫鉴别方法的建立奠定了坚实的基础。     

重组猪源CD40L体外诱导猪肺泡巨噬细胞IL-1β和TNF-α的分泌

本试验旨在研究重组猪源CD40L蛋白(recombinant porcine CD40L,rpCD40L)的生物学活性。利用Alexa Fluor 488标记rpCD40L后,在体外与CD40+原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)作用,荧光显微镜观察rpCD40L与PAMs的结合,并通过qPCR、ELISA检测作用12 h和24 h后PAMs IL-1β和TNF-αm RNA与蛋白水平的变化。结果显示,荧光标记的rpCD40L与CD40+PAMs作用后,PAMs呈现绿色荧光,rpCD40L与PAMs作用后在基因和蛋白水平促进了IL-1β和TNF-α的表达。结果表明,课题组前期获得的rpCD40L能够与CD40+PAMs结合,且诱导PAMs IL-1β和TNF-α的分泌。     

白花蛇舌草黄酮注射液对小鼠脾淋巴细胞的免疫增强作用

为探索自制白花蛇舌草黄酮注射液的免疫增强作用,测定了小鼠脾淋巴细胞的增殖情况,CD8+T细胞表面活化抗原CD69和CD25的表达以及细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的含量。结果显示,白花蛇舌草黄酮注射液在适当的浓度范围内能促进小鼠脾淋巴细胞增殖,促进CD8+T细胞活化以及细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的分泌。结果表明,自制的白花蛇舌草黄酮注射液具有免疫增强作用。     

锌与维生素A对隐孢子虫感染小鼠免疫功能的影响

为探讨锌和维生素A对隐孢子虫感染小鼠免疫功能的影响,将75只清洁级昆明小鼠随机分成5组,各组均饲喂基础日粮。其中Ⅰ组和Ⅴ组不添加锌和维生素A,Ⅱ组以饮水方式添加锌(38.5μmol/mL),Ⅲ组以灌喂的方法添加维生素 A(400 IU/只),Ⅳ组添加锌和维生素 A,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组均在试验开始时灌喂小型隐孢子虫卵囊( 2.56×106/mL),Ⅴ组作为不接种对照。试验结果,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组小鼠的粪便排卵量和排卵持续时间分别显著低于Ⅰ组(P<0.05);在试验的第 2 周和试验结束时,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组小鼠血液中CD4、CD8细胞百分率以及CD4/CD8比值均极显著高于Ⅰ组(P<0.01)。表明,锌和维生素A均能够增强小鼠的细胞免疫功能,提高机体抗隐孢子虫感染的能力。     

猪瘟病毒感染猪外周血白细胞凋亡及CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的变化

为了解猪瘟病毒(CSFV)石门株强毒感染对免疫细胞的影响以及免疫细胞的变化动力学,用流式细胞仪对人工感染猪的白细胞凋亡以及CD4 和CD8 T淋巴细胞亚群的动态变化规律进行了检测.结果表明,攻毒后CD4 和CD8 T淋巴细胞比例急剧下降,CD4 T淋巴细胞比例在攻毒后第4 d和第7 d分别由攻毒前的26.87%下降到8.83%和13.86%,CD8 T淋巴细胞比例由攻毒前的28.17%分别下降到14.19%和17.55%.外周血白细胞凋亡的检测结果显示,发病初期感染组凋亡细胞和早期凋亡细胞均显著高于对照组,表明CSFV诱导细胞凋亡是导致免疫细胞减少和免疫抑制的主要原因.