番鸭呼肠孤病毒YB株NS基因的序列分析及原核表达

为实现番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株NS非结构基因的克隆分析及原核表达,首先经RT-PCR扩增NS基因的完整编码序列(CDS),并将其克隆到p ET-32a(+)载体中。测序后对获得的NS基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。测序结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株NS基因的原核重组质粒p ET-YB-NS,并获取了NS基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB NS基因的CDS大小为1 908 bp,编码635个氨基酸;该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为98.2%~99.4%。遗传进化树分析显示,MDRV-YB株处于传统型MDRV分支上。该蛋白氨基酸序列中并不含有潜在的信号肽序列,但是含有2个潜在的N-糖基化位点以及61个磷酸化位点。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示,成功高效表达出分子质量约为88.7 ku的融合蛋白(p-NS),表达时IPTG最佳诱导时间、浓度和温度分别为5 h、0.4 mmol/L和36℃。Western-blot结果显示,表达的p-NS蛋白能特异性识别MDRV阳性血清,表明表达产物具备良好的反应原性。上述结果表明,MDRV NS非结构基因的克隆分析及其蛋白表达的实现,为进一步研究MDRV NS蛋白功能奠定了基础。     

猪戊型肝炎病毒ORF2 C-端主要抗原区的克隆及原核表达

为研究猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2C-端主要抗原区的原核表达产物是否具有抗原性,用PCR技术对猪戊型肝炎病毒ORF2C-端基因进行扩增,经克隆与序列分析,发现该基因片段编码289个氨基酸残基。将该目的片段连接到原核表达载体pET-28a(+)中,转化表达菌BL21(DE3),成功构建了重组质粒pET-HEV-ORF2-C,其重组菌于37℃、0.5mmol/L IPTG诱导表达4h后,菌体裂解物经SDS-PAGE分析,在分子质量约为34ku处出现一新蛋白带,与预期的目的蛋白分子质量相符。质谱鉴定表明,成功地表达了HEV-ORF2C-端蛋白。Western-blot和抗体效价检测分析结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性。     

番鸭呼肠孤病毒YB株μA基因的克隆分析与原核表达

为了对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)μA基因进行克隆分析和原核表达,本研究设计了1对特异性引物,对MDRV-YB株的μA基因进行RT-PCR扩增,扩增产物经过双酶切后克隆到p ET-32a(+)载体中,经测序验证成功后,将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。随后对表达产物进行SDS-PAGE以及W estern-blot分析。结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株A基因的原核重组质粒,并获取了A蛋白的基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB株μA基因CDS大小为2 199 bp,负责编码732个氨基酸,该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为83.8%~99.7%,与新型鸭源呼肠孤病毒(NDRV)的同源性约为82.5%,与鹅源呼肠孤病毒(GRV)同源性为80.9%,而与禽(鸡源)呼肠孤病毒(ARV)的同源性仅为73.1%;进化树分析μA基因的结果显示,MDRV-YB株属于传统型呼肠孤病毒,该蛋白氨基酸序列中无潜在的信号肽序列,6个潜在的N-糖基化位点以及45个磷酸化位点;SDS-PAGE分析表明,目的蛋白为分子质量约为99.7 ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其IPTG最佳诱导温度为33℃,浓度为0.8 mmol/L,时间为6 h;Western-blot结果显示,表达的目的蛋白能与抗MDRV阳性血清发生特异性反应,表明其具备良好的反应原性。本研究为进一步探索MDRV μA蛋白功能奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒CH/S株M蛋白全长的原核表达及其反应原性分析

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/S株M蛋白的基因组序列,设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出M基因,将其克隆至原核表达栽体pMXB10,构建了重组质粒pMXB-M,经测序鉴定正确后转化感受态细胞BL21(DE3),并进行了IPTG诱导表达.结果显示,重组茵pMXB-M表达的融合蛋白MBP-M-CBD(rM)...     

猪巨细胞病毒四川株gB基因的克隆表达及抗原性分析

为研究猪巨细胞病毒(PCMV)SC株gB蛋白的免疫学活性,采用PCR扩增PCMV SC株gB全基因和不含跨膜区及信号肽的gB基因片段,将后者克隆至pET-30a(+)载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导以获得高效表达。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,分别用琼脂扩散试验和Western-blot对多克隆抗体和复性的gB蛋白进行检测。结果显示,扩增的PCMV gB基因全长2 580bp,编码860个氨基酸。与国内外参考株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为97.8%～99.5%和96.6%～99.0%;与其他9株β疱疹病毒核苷酸和氨基酸序列相似性分别为33.3%～41.4%和13.3%～49.4%;系统进化分析显示,PCMV与人疱疹病毒6型和7型属于一个分支。gB肽链N端1～23位氨基酸为信号肽,729～751位氨基酸间含有跨膜区。构建的表达载体pET30a-gB-B在Rosetta(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导后以包涵体形式表达出大小约80ku的蛋白。所制备的血清琼扩抗体效价为1∶16,Western-blot显示重组gB蛋白可与PCMV阳性猪血清反应。结果表明,PCMV gB基因较为保守,与国内外不同地区的PCMV毒株具有较高的相似性,所表达的重组蛋白具有很好的抗原性。     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型标准菌株基因组为模板,用PCR扩增ApxⅠBD基因的特异性片段;对PCR产物纯化回收后与载体pMD 18-T进行连接、转化,经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pETⅠBD;转入大肠埃希氏菌BL21中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳。结果,从APP中克隆的ApxⅠBD DNA序列与已发表序列的同源性为100%,长1 447 bp,编码482个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku,与预期的大小相符。结果表明,含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

边缘无浆体MSP5蛋白基因的克隆及原核表达

参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5(MSP5)基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因。将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析。结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体。将其转化到DH5α宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku。Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别。     

绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜基因的定向克隆与融合表达

根据绵羊肺腺瘤病毒(SJRV) NM株基因组全序列,设计了 1 对包含囊膜(env)基因在内的引物,并在5′端分别设计了HindⅢ和 BamHⅠ酶切位点,利用 PCR技术扩增 env基因,通过连接反应将其克隆于pET 30b表达载体上。序列分析表明,env基因全长 1 836 bp,编码 612 个氨基酸残基;构建表达重组质粒env pET 30b,转化大肠埃希氏菌 BL21,经 IPTG于 37 ℃诱导培养,SDS PAGE电泳分析表明,表达的env基因融合蛋白分子质量约为69 ku。     

尤凯帕病毒HN基因的克隆与原核表达

通过提取尤凯帕病毒 (Yucaipavirus ,PMV 2 )的RNA ,进行RT PCR ,获得了HN基因。序列分析结果表明 ,HN基因的ORF全长为 174 3nt,编码一由 5 80个氨基酸组成的蛋白。HN基因经双酶切后连接入 pTYB 2原核表达载体。酶切鉴定筛选阳性克隆 ,用IPTG诱导表达 ,经SDS PAGE电泳和Western blotting检测均可见一约 110ku的目的条带 ,说明大肠埃希氏菌表达的HN蛋白能与抗PMV 2阳性血清特异性结合。     

赤羽病病毒N基因硫氧还蛋白融合表达载体的构建与表达

为获得赤羽病病毒 (Akabanevirus ,AKAV )的核蛋白重组抗原 ,根据其基因序列(SmRNA)设计合成了 1对特异性引物 ,对AKAVN基因进行RT PCR扩增 ,产物大小约为 6 96bp ,回收纯化后 ,将其克隆至 pMD18 T质粒载体中 ,经核苷酸序列分析 ,与已报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白N的SmRNA基因比较后发现 ,所测定毒株的核苷酸序列与TIN毒株的同源性高达 98.3% ,推测的氨基酸同源性为 97.6 % ,证实为AKAV的N基因。将该基因片段亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体 ,转化TOP10细胞 ,成功地构建了AKAVN基因重组表达载体。经L araboinose诱导表达 ,可稳定、高效地表达AKAV核蛋白抗原。表达蛋白为融合蛋白 ,分子质量约 4 2 .5ku ,其表达产量约占菌体总蛋白的 2 8% ,融合蛋白中含有AKAV特异性核蛋白抗原 ,可作为ELISA包被抗原