生物芯片及其在疾病诊断中的应用

1991年Fodor等[1] 提出DNA芯片的概念后 ,近年来以DNA为代表的生物芯片 (biochip)技术得到了迅猛的发展。目前 ,已有多种不同功用的生物芯片问世 ,这将为生命科学的研究、疾病诊断和治疗、新药的开发、司法鉴定、食品卫生监督和航天航空等领域带来一场革命[2 ] ,特别是在遗传病、肿瘤病、感染性疾病及其他一些疑难疾病的诊断中取得重大突破。1　生物芯片简介生物芯片技术是将生物分子 (寡聚核苷酸、cDNA、基因组DNA、多肽、抗原、抗体等 )固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵 ,在待分析样品中的…     

电化学免疫检测技术简介

电化学免疫检测技术是近十几年发展起来的一种微量检测新技术,主要用于生物活性物质如抗原、抗体、激素等的检测。它将免疫反应的特异性和微电子技术结合,使免疫检测具有精度高、速度快、适合于小型化和集成化,显示了广阔的发展前景。(一)原理 电化学免疫检测是根据抗原、抗体特异结合的原理,首先把抗体或抗原结合在载体或电极表面,即进行抗体或抗原的固化。然后用固化的抗体或抗原与待测样品中的抗原或抗体反应,用直接或间接法测量电化学信号的变化,从而得出待测样品中抗原或抗体的浓度。(二)分类 电化学免疫检测技术大致可以分为两大类:1.直接测量法:是利用抗原、抗体反应产生抗原—抗体复合物的膜电位,用电化学传感元件测     

消除副结核菌交叉反应机理的探讨

本试验用吸收处理、免疫转印技术分析了5种分枝杆菌抗血清:副结核阳性血清、牛型结核阳性血清、草分枝杆菌牛抗血清、堪萨斯分枝杆菌牛抗血清和偶发分枝杆菌牛抗血清经草分枝杆菌胞浆蛋白吸收处理前后与副结核菌P18株胞浆蛋白各组分抗体反应性的变化,以及副结核阳性血清经牛型结核菌全菌体、胞浆蛋白吸收处理前后抗体反应性的变化。其结果:草分枝杆菌胞浆蛋白的吸收处理可以在很大程度上消除或减弱因感染牛型结核菌、草分枝杆菌引起的交叉反应,而对消除或减弱偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌的交叉反应的作用不理想,吸收前后,对副结核菌的抗体反应影响不大。与副结核菌有交叉反应的牛型结核菌抗原既存在于菌体表面,也存在于胞浆中,与25.4KD副结核菌胞浆蛋白分子有交叉反应的牛型结核菌抗原存在于胞浆中,24.6KD副结核菌胞浆蛋白抗原是副结核菌的特异性抗原。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用微芯片荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立一种可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用的核酸检测技术,本研究根据已发表的多株PRRSV ORF6(M)基因保守序列,设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,成功建立了一种可用于PRRSV通检的微芯片荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,与多种常见的猪病病毒均无交叉反应;通检性好,可以检出包括美洲型、欧洲型、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及NADC30-like等多种基因型PRRSV毒株;灵敏性好,检测下限为1×10~1TCID_(50)/mL,与常规荧光RT-PCR方法一致;重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于4%;且成本低,模板用量少,反应快速,全程仅需61 min;对80份临床样品的检测结果与常规荧光RT-PCR的符合率为100%。本研究建立的微芯片荧光定量RT-PCR技术为PRRSV的快速、通用型检测提供了有力的技术支撑。     

免疫萤光技术在兽医诊断上的应用

免疫萤光技术,是根据免疫学上的抗原和抗体相遇时,发生特异性的反应这一现象,即将已知抗体(或抗某种传染病的血清)用一种萤光色素处理,使其互相结合,然后用这种含有萤光色素的抗体,对未知抗原(或病原材料)进行染色,染色后在紫外线显微镜下观察。如果抗原和抗体之间存在有特异性,则显示有特异萤光,从而可以识别未知抗原。     

沙门菌PCR快速检测试剂盒的研制与应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的沙门菌检测方法,根据沙门菌fimY保守基因序列设计合成了1对引物,建立了快速检测沙门菌的PCR方法,并对反应条件进行优化,组装成快速检测试剂盒。结果显示,所有沙门菌均扩增出526 bp的特异性条带,而非沙门菌均未扩增出任何条带。检测灵敏度达93 CFU,还可检出含3 CFU的样品用BP预增菌的菌液或用MM增菌后的菌液,而且稳定性良好,冷冻至少能保存12个月。采用直接菌体加入法、热裂解法、反复冻融法、CTAB碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板,结果CTAB法效果最好,但操作烦琐,而直接菌体加入法和热裂解法可以达到和柱式试剂盒提取法相同的效果,且操作简便、快速、经济、效果好。通过对临床样品的检测,证实该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点,值得推广应用。     

鸡胸腺肥大细胞的超微结构观察

肥大细胞（Ｍａｓｔｃｅｌ,ＭＣ）是重要的免疫细胞,能分泌多种生物活性物质,在速发型变态反应和炎症反应中起重要作用,并可能与抗寄生虫感染、抗肿瘤等有关。我们曾用组化方法在鸡胸腺实质内观察到大量的ＭＣ,在此基础上,本试验进一步探讨了鸡胸腺（ＭＣ）的超微结...     

猪瘟病毒免疫的细胞学研究进展

猪瘟 (Ｈｏｇｃｈｏｌｅｒａ ,ＨＣ或Ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ ,ＣＳＦ)是造成养猪业巨大经济损失的主要传染病之一。尽管在最近几年 ,由于分子生物学技术的发展和应用 ,对猪瘟病毒 (ＨＣＶ )的研究有了很大进步 ,但还存在着许多亟待解决的问题 ,如ＨＣＶ病毒粒子的结构、感染的分子基础、非结构蛋白的功能、病毒在细胞中增殖及其与宿主细胞的关系、免疫应答机制等。尤其在 2 0世纪70年代后期 ,出现猪瘟免疫失败的现象 ,使人们研究的重点开始转向对ＨＣＶ感染和免疫机制的研究。为此 ,本文将从ＨＣＶ在细胞中的增殖、病毒与…     

单抗介导的间接荧光抗体技术快速诊断鸡传染性支气管炎的研究

用筛选的一株反应谱较广的抗传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）单克隆抗体ＭＣ做一抗，建立了间接荧光抗体技术快速诊断鸡传染性支气管炎（ＩＢ）的方法。采病鸡肺和肾做压印片按常规方法进行间接荧光法染色、镜检，阳性者可见肺或肾细胞呈黄绿色荧光，阴性者则无染色反应。用该法对呼吸型代表株Ｍ＿４１、肾型代表株澳大利亚Ｔ株及野毒ＲＳ株攻毒的ＨＭ模拟ＩＢ病鸡群进行诊断，同时设Ｈ＿１２０、ＮＤＶ攻毒组及空白组做对照，结果Ｍ＿４１组、Ｔ组及ＲＳ组均呈阳性反应，而ＮＤＶＦＬ及空白组均为阴性，Ｈ＿１２０攻毒组仅在４８ｈ内呈弱阳性，说明疫苗毒在体内持续时间较短。同时还对攻毒后不同时期的鸡肺、肾内ＩＢＶ的含量及分布规律进行了研究，为ＩＢ的诊断提供了可靠依据。本方法应用于诊断ＩＢ具有快速、敏感、特异等优点。     

小反刍兽疫病毒RT-PCR检测方法的建立

通过分析小反刍兽疫病毒(PPRV)不同毒株的N基因序列,根据N基因保守区序列设计了1对引物,根据肌动蛋白基因序列设计了另1对引物作为内参,建立了小反刍兽疫RT-PCR诊断方法,预期扩增片段分别为687bp和493bp。以PPRVNigeria75/1株RNA和山羊组织总RNA混合物为模板,在RT-PCR反应体系内同时加入绵羊肌动蛋白基因引物和PPRVN基因引物,结果可扩增出2条目的条带,序列测定结果证实,分别扩增出了目的基因。对RT-PCR反应条件进行了优化,在最佳反应条件下,该RT-PCR最低可检测到12TCID50/mL的病毒RNA。用该方法对人工感染PPRVNigeria75/1株山羊的血液样品进行检测,结果可扩增出目的基因片段。表明建立的RT-PCR方法具有较好的特异性、敏感性和准确性。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-LAMP检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守序列各设计一套LAMP引物,在同一体系中进行RT-LAMP扩增,通过对体系内引物浓度及反应温度等进行优化,建立了可在63℃恒温下对CSFV和PRRSV进行同步检测的LAMP方法,并进行了敏感性和特异性试验。结果显示,该方法的灵敏度与荧光定量RT-PCR相当,与常规RT-PCR相比高10倍;用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型进行RT-LAMP扩增,均未发生交叉反应。用该法对采自天津市4个猪场的52份临床样品进行检测,与荧光定量RT-PCR检测结果的符合率为100%。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,可实现两病原的同步快速检测,是临床疫病初筛技术的强有力候选。     

绵羊铅镉联合中毒与硒解毒的试验病理学研究

用口服醋酸铅和氯化镉的方法观察Ｐｂ、Ｃｄ对绵羊的联合中毒作用，并通过肌注亚硒酸钠研究硒的解毒效应。结果成功地复制出了与本动物自然中毒病例相似的模型。临床病理学上试验的第３０ｄ左右即出现典型的低色素小细胞性贫血，并伴随体内Ｐｂ、Ｃｄ含量的明显升高和Ｆｅ含量的显著下降。病理组织学特点为肝、肾等实质器官的退行性变化及肺脏的慢性肺泡隔炎和纤维结缔组织增生。肝、肾、肺及心脏均有明显的超微结构变化。补硒能有效地缓解或减轻Ｐｂ、Ｃｄ共同引起的毒性损伤。     

猪瘟兔化弱毒疫苗RT-LAMP检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)野毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的NS5B基因序列,利用在线软件Pri mer Explorer V4Software,设计了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP)引物,建立了特异性检测HCLV的RT-LAMP方法。在BstDNA聚合酶作用下,65℃恒温反应1h即可完成扩增过程,扩增产物可通过20g/L琼脂糖凝胶电泳或加入SYBR GreenⅠ染料进行分析。经检测,该方法对于CSFV、BVDV以及其他猪源病毒无特异性扩增,具有良好的HCLV特异性;其灵敏度与本实验室建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测结果一致,均达到5个拷贝。分别用这两种方法对58份市售猪瘟弱毒疫苗进行检测,结果符合率达100%。表明,建立的HCLV RT-LAMP技术可以应用于基层实验室或养殖场,便于养殖户对疫苗中的弱毒含量进行监测。     

论企业策略联盟的实施

所谓策略联盟 ,是指两个或两个以上的相关企业 ,为了实现某一战略及构筑独特的竞争优势 ,共同投入资源 ,结合事业体的某一价值链而形成的战略伙伴关系。它是基于成本、效率以及竞争优势等因素的考虑 ,从战略上与其它企业建立的一种较为长期而松散的关系网络。依靠这种网络 ,不同企业之间可以通过在技术、产品、资金或市场等环节上的合作、交流或授权 ,提高企业自身及联盟整体的经济实力、技术实力和生产实力 ,避免相互间的恶性竞争 ,以获得良好的市场发展空间。当今 ,任何一个企业所拥有的资源 ,包括人力、物力、财力、科技能力、制造能力以…     

可溶性CD_2分子及其配体的功能研究

检测了绵羊、猪红细胞培养上清中可溶性ＣＤ２配体（ｓＣＤ２Ｌ）和猪血清可溶性ＣＤ２分子（ｓＣＤ２）在猪外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）增殖及对绵羊红细胞破坏中的作用。结果表明，ｓＣＤ２对绵羊红细胞的溶血作用可被ｓＣＤ２Ｌ所抑制，ｓＣＤ２Ｌ的这种抑制作用随其红细胞培养浓度在一定范围内的升高而加强；绵羊红细胞培养上清中ｓＣＤ２Ｌ能单独或辅助植物血凝素Ｐ（ＰＨＡＰ）促进猪ＰＢＭＣ增殖，其作用强弱与红细胞培养浓度密切相关，当绵羊红细胞浓度为１．４×１０９个／ｍＬ时效果最佳。ｓＣＤ２对ｓＣＤ２Ｌ诱导的猪ＰＢＭＣ增殖具有抑制作用，抑制作用随ｓＣＤ２水平上升而增强。     

白细胞介素3对猪瘟病毒E_2基因疫苗免疫增强作用的研究

以昆明系小白鼠为试验动物,观察了白细胞介素３（ＩＬ３） 对猪瘟病毒Ｅ２ 囊膜糖蛋白（ ＨＣＶ Ｅ２） 基因疫苗免疫效果的增强作用。用ＤＮＡ 重组技术将ＨＣＶ Ｅ２ 基因和小白鼠ＩＬ３ 基因克隆到ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ 质粒,因在两者之间有脑心肌炎病毒（ＥＭＣＶ） 的核糖体进入位点（ＩＲＥＳ） 片段,可得到ＨＣＶ Ｅ２ 基因和小白鼠ＩＬ３ 基因双表达质粒ｐＩＲＳＴ ＩＬ３ ,用ｐＩＲＳＴＩＬ３ 免疫小白鼠后,经ＥＬＩＳＡ 法检测免疫小白鼠血清中抗ＨＣＶ Ｅ２ 抗体效价。结果显示,ＩＬ３ 能显著提高ＨＣＶ Ｅ２ 基因疫苗的免疫效果,表明ＩＬ３ 可作为ＨＣＶ Ｅ２ 基因疫苗的细胞因子佐剂。     

奶山羊“酸奶病”病因的研究

自应用酒精法检验奶山羊鲜奶以来,养羊户和收奶员反映,经酒精一测,不少鲜奶顿时就成了“酸(坏)奶”,分泌“酸(坏)奶”的羊也就被认为是患有“酸奶病”,致使养羊户只好将“酸奶”喂猪或上地,并到处求医寻药,或将“酸奶病”羊卖给他人。结果,既浪费了奶源,也挫伤了农户养羊的积极性。为了解决生产中存在的问题,七个单位协作从“奶山羊奶酒精反应阳性与酸奶病”、“奶山羊奶酒精反应与滴定酸度及煮沸试验”和“奶山羊奶酒精反应与奶中主要无机离子的关系”等方面进行了研究,其结果报道如下。     

基因工程抗体的研究进展

基因工程抗体 (geneengineeringantibody ,GEAb)是通过PCR技术获得抗体基因或抗体片段基因 ,与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体 ,被广泛应用于疾病的临床诊断、预防和治疗、基础理论研究等诸多领域 ,并取得令人鼓舞的结果。鉴于鼠源性单抗会引起人抗鼠抗体反应 ,影响疗效而不能重复使用 ,同时用杂交瘤技术生产单抗成本较高而难以普及 ,于是各国学者即而转向GEAb的研究。 1984年 ,国外首次报道在骨髓瘤细胞中成功表达人 鼠嵌合抗体 ,开创了GEAb技术的先河[1] 。 1988年以来 ,伴随着用大肠埃希氏菌成功表达具生物活性抗体片…     

在蚀斑减少中和试验和放射免疫扩散试验中正常牛血清对口蹄疫病毒的交叉反应

摘要 曾用蚀斑减少中和技术和放射免疫扩散技术对150头非已知接触口蹄疫病毒的牛血清进行了检验,以估价在这些试验中交叉反应的意义和程度。对采自五个地区每个地区30头牛的血清,用7个型中各型有代表性的口蹄疫病毒进行检验。在特定的组群血清中,用放射免疫扩散技术和蚀斑减少中和技术发现在同一时间中均 有交叉反应的高水平。也看到用蚀斑减少中和技术对亚洲、南非Ⅰ、南非Ⅱ、南非Ⅲ型比对A、O或C型毒交叉反应的水平高,而用放射兔疫扩散技术对南非Ⅱ和南非Ⅲ型交叉反应水平也较高。对大多数血清反应的表现是颇为特异性的;已知血清往往仅同一或二种病毒有反应。     

检测口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体的斑点免疫金渗滤法的建立

为建立一种能够区分口蹄疫疫苗免疫与野毒感染动物的快速检测方法,将纯化的口蹄疫病毒3AB非结构蛋白抗原包被在硝酸纤维素膜上,加入待检血清样品后,利用胶体金标记SPA显色。应用斑点免疫金渗滤技术(DIGFA)和ELISA方法同时对150份猪血清进行检测,结果DIGFA法的阳性率为6%(9/150),ELISA法的阳性率为5.3%(8/150),两者符合率达99.3%。DIGFA操作简单,耗时短,结果易于判断,且与口蹄疫免疫猪血清、猪细小病毒、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应。结果表明,该法适用于生猪和牛等口蹄疫病毒3AB抗体的快速检测。