新城疫病毒La Sota疫苗株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

为构建能为新城疫病毒拯救提供直接使用的全长cDNA克隆,利用分子克隆的方法,将新城疫病毒La Sota株全基因组分成末端部分重叠的11个片段(F1～F11),按其基因组顺序克隆至改造后的真核表达载体pVAXr上,同时在全长cDNA两侧引入T7启动子和丁型肝炎病毒核酶(Rib)序列,以确保病毒基因组转录产物的两端形成精确的核酸序列。鉴定结果表明,新城疫病毒La Sota株基因组全长cDNA已成功克隆至pVAXr上,命名为pVAXr-FL。本研究为新城疫病毒的拯救及外源基因的表达奠定了基础。     

表达流行毒株VP2蛋白的IBDV重组疫苗株rGtHLJVP2的构建及其免疫效力的评价

为应对传染性法氏囊病病毒(IBDV)变异毒株及超强毒株(vvIBDV)等突发疫情的出现,解决传统疫苗株筛选费时费力的难题,在流行病学调查的基础上,克隆了超强毒株HLJ0504的VP2基因,并突变细胞嗜性决定氨基酸位点(Q253H/A284T),用其替换IBDV弱毒株Gt基因组的相应区段,成功获得1株表达流行vvIBDV VP2蛋白的重组病毒rGtHLJVP2。体内、外复制动力学研究表明,该重组病毒与亲本病毒Gt的复制能力相当。动物试验结果表明,该重组病毒对接种鸡无明显致病性,接种鸡法氏囊指数均在0.7以上,法氏囊无明显萎缩现象。该重组病毒可以诱导机体产生良好的免疫应答,其抗体水平明显高于亲本毒,能够完全抵抗vvIBDV的攻击。另外,该重组病毒具有良好的遗传稳定性。本研究结果为新型传染性法氏囊病疫苗的研发奠定了基础,对于IBDV突发疫情的应急防控具有重要意义。     

三株传染性法氏囊病病毒超强毒株全基因组的克隆与序列分析

为了获得本实验室3株(HuB-1、HeB10XS02、SD10LY01)传染性法氏囊病病毒(IBDV)分离毒株的全基因组序列,并了解其序列特征,首先测定了这3株毒株对SPF鸡的致死率,然后利用融合PCR技术扩增获得全基因组序列,对其进行遗传进化分析。结果显示,3株毒株对SPF鸡的致死率均在60%以上,为IBDV超强毒株(vvIBDV)。遗传进化分析表明,3株分离毒株的A节段均位于超强毒分支。IBDV的B节段分为明显的3个亚群,其中HuB-1、SD10LY01的B节段属于第Ⅲ亚群,HeB10XS02的B节段则属于第Ⅱ亚群。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚群之间在VP1蛋白上存在17个保守氨基酸差异位点,其中第145~147位氨基酸形成独特的"三联体"基序,不同亚群具有不同的基序。本研究结果为更好地了解vvIBDV基因组特征以及致病性分子基础的研究提供了重要理论依据。     

传染性腔上囊病病毒超强毒致弱株GZ20 VP2 基因的克隆和序列分析

根据已发表的52/70株传染性腔上囊病病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了一对特异扩增IBDV VP2基因的引物.以超强毒IBDV(vvIBDV)致弱株GZ20基因组为模板利用RT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物,将VP2基因克隆于pUC119质粒上,得到重组pUC119质粒.并对VP2基因全序列测定,序列分析和聚类分析表明,该致弱株与无毒疫苗株PBG98和弱毒株CU-1非常相似,而与经典强毒株、超强毒株和变异株相差较大.这提示该致弱株属于标准血清Ⅰ型弱毒株.     

传染性腔上囊病病毒HN01超强毒株VP2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的传染性腔上囊病病毒(IBDV)标准强毒株52-70株基因组序列,设计并合成了1对扩增IBDV VP2基因的特异性引物.以IBDV超强毒分离株HN01感染发病鸡腔上囊组织中提取的病毒RNA为模板,用RT-PCR扩增出了1.45 kb的cDNA产物,将扩增的IBDV HN01株VP2基因克隆于pMD 18-T载体上,获得了pMD 18-T-VP2重组质粒.将IBDV HN01株 VP2基因序列测定结果与已发表的其他IBDV毒株VP2基因序列进行分析比较,绘出系统进化树.结果表明,HN01株与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM、香港超强毒株HK46等非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大.     

表达IBDV AH1株VP2嵌合法氏囊素三肽基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫功能分析

为研究传染性法氏囊病(IBD)重组火鸡疱疹病毒(HVT)的构建策略,以HVT FC126基因组非必需区UL44~UL45为插入位点,构建带有大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因序列(gpt)标记的HVT转移载体质粒pUAB-gpt。然后构建表达IBDVAH1株VP2嵌合法氏囊素三肽(BS10)表达盒并克隆入pUAB-gpt,获得转移载体质粒pUAB-Pec-BS10-VP2-Egpt。将该转移载体与HVT DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过间接免疫荧光试验(IFA)、IBDV抗体夹心ELISA检测、Western-blotting分析,结果显示,获得了表达VP2基因的重组HVT病毒rHVT-Pec-BS10-VP2。将该重组病毒免疫1日龄SPF鸡,免疫后第14天,鸡群可以检测到IBDV抗体。免疫后第21天,脾淋巴细胞增殖活性反应显著。证明IBD重组火鸡疱疹病毒构建成功。     

新城疫病毒Mukteswar毒株反向遗传系统的建立

为了建立新城疫病毒(NDV)Mukteswar毒株的反向遗传操作系统,根据已测定的NDV Muk-teswar毒株的全基因组序列设计了5对引物,扩增出包含全基因组cDNA的5条片段,并按一定顺序依次克隆入pSL1180载体中,然后在cDNA 5′末端插入T7启动子序列,3′末端导入具有自我剪切功能的丁肝病毒核酶序列和T7转录终止信号,构建了能转录具有精确5′和3′末端全基因组cDNA的转录载体pNDVT7。将表达核蛋白、磷酸蛋白及转录大蛋白的辅助表达载体pCIneoNP、pCIneoP和pCIneoL与pNDVT7按一定比例混合共转染BRS-T7细胞,4 d后将细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚,结果获得了高效价的重组病毒。表明本研究建立的反向遗传系统能高效、快速拯救重组新城疫病毒毒株。     

口蹄疫病毒Asia 1/JSWX株基因组全长感染性克隆的体外拯救与序列分析

通过反转录聚合酶链反应,获得了口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JSWX株基因组3′端长片段(长约7.5kb)和5′UTR中ploy(C)前后的2个短片段。5′UTR的2个短片段经融合PCR扩增得到长约710bp的片段。用引物在基因组5′末端引入AflⅡ酶切位点和T7启动子,在5′UTR内引入SpeⅠ酶切鉴定位点,在3′末端引入NotⅠ酶切位点,将融合片段和3′端长片段顺次连接到载体pSL1180。经T7体外转录系统获取的RNA转录本与脂质体共转染BHK21细胞。测序结果表明,构建的病毒基因组全长cDNA为8 197nt,分别包括1个长为1 095nt的5′UTR[含有1个17nt的ploy(C)];1个长6 990nt的ORF;1个长为93nt的3′UTR;之后是18nt的poly(A)尾巴。该全长cDNA克隆与Asia 1/Jiangsu/China/2005株基因组序列的同源性为98.4%。测序和酶切鉴定结果均表明,该口蹄疫病毒株全长cDNA克隆已构建成功,该方法极大地简化了获得FMDV全长cDNA克隆的过程。通过反转录聚合酶链反应、间接免疫荧光试验和蚀斑试验等鉴定,本试验获得了感染性分子克隆;体外拯救获得的基因工程病毒连续传代培养后,可致BHK21细胞产生病变。上述结果表明,构建的cDNA克隆可以作为基因操作的载体,为深入研究安全性好、稳定性高和免疫原性强的基因工程疫苗奠定了基础。     

基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆的构建与生物学特性

参考甲型塞内卡病毒（SVA）CH/HuB/2017株全基因组序列,构建SVA通用型载体,合成SVA FragⅠ和FragⅡ基因片段,并通过无缝克隆技术依次将病毒基因片段插入通用型载体,获得包含病毒全基因组的真核转录质粒pcDNA-SVA;经双酶切和测序验证后,在IBRS-2细胞上进行转染和传代,以获得拯救毒株rSVA-CH/HuB/2017;经遗传稳定性评价后,利用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光和半数组织培养感染量等试验,鉴定和分析拯救毒株在猪肾细胞系IBRS-2和PK-15中的生物学特性。结果显示,重组质粒pcDNASVA直接转染普通敏感细胞系IBRS-2,即可快速拯救出含有沉默突变NheⅠ分子标记的毒株,且具有良好的遗传稳定性;拯救毒株和野生亲本毒株在IBRS-2和PK-15细胞中的复制和增殖特性相似。结果表明,通过建立一种基于T7启动子、RNA聚合酶Ⅱ启动子、终止子、核酶HamRz和HDVRz等元件的SVA单质粒高效拯救系统,可以在质粒水平快速编辑病毒基因组,为定向改造和拯救病毒提供了基础性技术平台。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

云南省红河州山羊流产病原的调查

针对红河州山羊妊娠期流产严重的现象 ,进行了流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、实验室诊断、人工感染试验和治疗试验。结果发现 ,妊娠母山羊流产现象覆盖全州 ,且流产率以每年 11.5 0 %的速度递增 ,弓形虫抗体阳性率为 30 .82 % (12 10 / 392 5 ) ,衣原体抗体阳性率为32 .31% (12 6 8/ 392 5 ) ,其中弓形虫和衣原体双重感染阳性羊占 9.35 % (36 7/ 392 5 ) ,未检出布鲁氏菌抗体阳性羊 ;自流产胎儿肺抹片中发现弓形虫滋养体包囊 ,7份流产胎儿中有 6份分离到衣原体 ;用土霉素及复方新诺明治疗有明显效果 ;人工感染试验能复制出与自然病例相同的病例模型。调查结果表明 ,红河州广泛流行的山羊妊娠期流产的病原是弓形虫、衣原体 ,2种病原单一感染或混合感染是造成流产的主要原因。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

朝鲜的核、导战略态势及其影响

朝鲜实施导弹发射和地下核试验,意在实现核拥有,籍以提高对美战略的筹码。朝鲜开展核战略角逐由来已久,先后展开过以守为攻;“边缘”对应;将计就计;以硬对强四个回合。角逐结果虽不乏战术上的小胜,却丧失了战略上的大胜。此番的导弹试射与地下核试验可视为第五个回合,是朝鲜核、导角逐战略“以攻为守”的转换。朝鲜执意实现核拥有纵有多种原因,却因核、导本身所拥有的“双刃剑”作用,带来于己、于他都不利的负面影响。包括:自食其言,愈加难以取信于国际社会;产生连锁反映,引发新一轮的军备竞赛;挑战核不扩散条约,难免遭到更大封杀;破坏合作气氛,延缓统一进程;置中国于尴尬境地,动摇中朝关系基础。朝鲜的“自行其事”难免遭到国际社会更加严厉的抵制。