链球菌群特异性IHA的建立和应用

采用链球菌C、D、E 和R 4 个血清群的参考菌株分别经十二烷基硫酸钠(SDS) 法制备群抗原致敏绵羊红细胞与相应的群特异性兔抗血清进行IHA 试验,均能发生特异性血凝反应,并有良好的重复性。血凝反应能够被致敏用的SDS抗原所抑制。IHA 试验中4 个血清群之间血清学反应与环状沉淀试验的结果一致。用以上两种方法对湖北省8 个疫区猪场共222 份血样群特异性抗体检测结果,二者总符合率为85 .78 % 。     

乳牛孕酮人工抗原的制备与鉴定

采用二环己基碳化二亚胺偶联法将孕酮-11α-半琥珀酸酯(11-αOH-P4-HS)分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)载体偶联,制备乳牛孕酮人工抗原P4-BSA和P4-OVA,并用SDS-PAGE对制备的人工抗原进行测定。再用制备的人工免疫抗原P4-BSA免疫BALB/c小鼠制备免疫血清。用P4-OVA作为ELISA检测抗原,方阵滴定法确定检测抗原的最佳包被浓度,间接ELISA测定免疫血清中抗体的特异性及效价。结果表明,成功制备了乳牛孕酮人工抗原,P4-OVA的最佳包被浓度为5.82×10-5ng/mL,最佳封闭液为50 mL/L的羊血清,免疫血清具有良好的特异性。     

丝状霉形体山羊亚种血清抗体间接ELISA检测方法的建立

利用丝状霉形体山羊亚种标准株PG3制备抗原,经纯化后作为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于检测丝状霉形体山羊亚种血清抗体。经方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为1.09μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物的最佳稀释度为1∶40 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h。判定标准为样品D490 nm值与标准阴性血清D490 nm值之比(P/N)≥3为阳性,≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑。重复性和稳定性试验证明,建立的间接ELISA的稳定性和重复性良好,与间接血凝试验相比,其敏感性较高。     

Dot-ELISA检测犬瘟热病毒抗原的研究

用建立的三抗体夹心法Dot-ELISA检测犬瘟热病毒(CDV)抗原,其抗原最低检出量为1.15μg/mL(0.57625ng/点),经与常规ELISA对104份自然感染犬的血液白细胞样本,60份眼结膜分泌物样本,73份脾、肝、淋巴结等脏器样本进行检测,检出的阳性率分别为92.31%、66.67%、83.56%和90.72%、63.29%、81.86%;两种方法检出的总阳性率分别为83.54%(198/237)和80.17%(190/237),总阳性符合率为95.96%,表明两者呈高度正相关(r=0.92,P＜0.01).Dot-ELISA和AGID对样本检测总阳性符合率为24.89%,呈差异极显著(X2=340.89,P＜0.01).经电子显微镜观察验证比较,三抗体夹心法Dot-ELISA检测的可信度为94.74%.     

牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症dot-ELISA诊断方法的建立

以纯化的菌体蛋白为诊断抗原,建立了牛D型产气荚膜梭菌特异性抗体的斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)检测方法,确定了各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1.95 μg/mL,血清稀释度为1:320,二抗稀释度为1:2000,封闭液为30 mL/L脱脂乳,抗原、血清、二抗和封闭液的作用温度及时间均为37℃30 min.用该dot-ELISA检测30份牛血清,纯化抗原比粗提抗原的阳性检出率高16.7%;dot-ELISA的灵敏度是琼脂免疫扩散试验(AGID)法的43倍;用dot-ELISA法对100份牛血清样本进行检测,阳性率为59.0%;经特异性试验、重复性试验和与AGID法比较,表明用纯化抗原建立的方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

利用超声波裂解法制备粪肠球菌的裂解物作为抗原包被酶标反应板,通过棋盘滴定方法筛选最佳反应条件,成功地建立了检测致羔羊脑炎粪肠球菌抗体的间接ELISA.在此间接ELISA中,抗原最佳包被浓度为37.57μg/mL,被检血清的最佳稀释度为1100.建立的间接ELISA的灵敏度是微量凝集反应的25～100倍.交叉试验、阻断试验、重复性试验表明,该方法具有重复性好、特异性强、操作简便快速等特点.确立的检测ELISA效价的回归方程lg[1/ET]=1.275 2.730 D405mm,可用于抗体定量测定.利用此方法检测了来自未免疫绵羊场的50份成年绵羊的血清和50份羔羊的血清;结果,2份成年绵羊的血清为阳性,其他样品均为阴性.     

用间接ELISA法检测鸡痘病毒抗体的研究

建立了检测鸡痘病毒抗体的间接ELISA方法 ,用该法检测 2 0份人工感染鸡血清样品 ,抗体阳性率为 10 0 % ,康复期鸡群血清抗体阳性率为 4 3% ,人工接种弱毒疫苗 6 5d和 170d鸡群血清抗体的阳性率分别为 6 0 %、70 %。经反复试验 ,确定了诊断抗原的制备方法和间接ELISA检测鸡痘抗体的最佳反应条件 ,即抗原包被浓度 10 .8μg/孔 ,待测血清最佳稀释度为 1∶10 0。     

应用间接血凝试验诊断牛肝片及吸虫病

1982年浙江省畜牧兽医研究所首次报道了用间接血凝(IHA)试验对湖羊肝片吸虫病进行早期诊断。1983年7～11月我们应用IHA试验诊断牛肝片吸虫病,并采用粪便水洗沉淀法(下称粪检法)做了比较验证,现将试验结果报告如下。 (一)材料与方法 1.抗原:肝片形吸虫抗原和对照红细胞悬液系本省农科院畜牧兽医研究所惠赠;牛日本血吸虫抗原来自宁海县卫生防疫站。 2.健兔血清(NRS):从健兔心脏抽血,分离血清,配成1％兔灭能血清(NRS)     

ABC-Dot-ELISA检测家兔抗华支睾吸虫IgG

免疫酶斑点试验(Do t-ELISA)检测抗体,具有敏感、简便等优点,因此,近年来被用于检测多种寄生虫抗原和抗寄生虫抗体。笔者利用亲和素-生物素(Avidin-Biotin)的生物放大作用,将Avidin Biotin-HRP Complex(ABC)与Dot-ELISA结合,建立了ABC-Dot-ELISA,用于检测人工感染华支睾吸虫家兔血清中的特异性IgG,同时做ABC-RLISA进行比较。(一)材料和方法1.抗原制备:按常规方法进行,蛋白质含量为5 mg/ml。2.生物素化羊抗兔地IgG(b-SARIgG)和     

Dot-ELISA诊断猪弓形虫病的研究

本文报道了应用硝酸醋酸混合纤维素薄膜作载体进行Dot-ELISA试验诊断猪弓形虫病的试验方法的建立。试验中,封闭液、洗涤液和稀释液采用levy等(1987)方法并加以改进,加入EDTA并提高了反应温度,使得在“快诊膜”做成后35分钟内完成整个试验。此外,还做了不同载体、不同底物和不同反应时间对试验结果的影响试验。通过对160头份猪血清进行Dot-ELISA、PPA-ELISA和IHA检测,其阳性检出率分别为38.13％、30.63％和23.75％。且不与猪囊虫、猪旋毛虫病和猪瘟发生类属反应。初步证实了Dot-ELISA优于PPA-ELISA和IHA。具有快、敏、特、简等优点,便于在基层推广应用。     

衣原体单克隆抗体在牛羊血清诊断上的应用

采用淋巴细胞杂交瘤技术,研制出的抗衣原体单克隆抗体,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,对本地区所采集的128份羊血清、90份牛血清进行检测.结果,羊血清阳性检出率为25.8%,牛血清阳性检出率为32.2%.选择50份羊血清、50份牛血清用已建立的检测衣原体抗体ELISA与间接血凝试验(IHA)进行比较,牛血清ELISA阳性检出率为32.0%,IHA为24.0%,ELISA比IHA试验高出8个百分点;羊血清ELISA阳性栓出率为26.0%,IHA为22.0%,ELISA比IHA高出4个百分点.     

弓形虫抗体免疫胶体金快速检测试纸条的研制

将样品垫(加样区)、包被了弓形虫排泄分泌抗原和胶体金结合物的结合垫、包被了弓形虫排泄分泌抗原和抗弓形虫抗体的硝酸纤维素膜、吸水垫依次首尾互相衔接粘贴在白色塑料板上,组装成检测弓形虫抗体的免疫胶体金快速试纸条。然后用其进行动物弓形虫病血清抗体检测,并用弓形虫IHA诊断试剂进行对照试验。经对已知弓形虫阴、阳性血清检测,与弓形虫IHA检测结果的符合率为82.5%,金标试纸条较弓形虫IHA诊断试剂能提前2 d检测到抗体。结果表明,检测弓形虫抗体免疫胶体金试剂(金标试纸条)的敏感度高于IHA。     

分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体杂交瘤株的建立

本试验以DEAE纤维柱层析法从感染小鼠血液中分离得纯净锥虫,再通过超声乳化,制备锥虫可溶性抗原,用其免疫BALB/c小鼠,再以此BALB/c小鼠脾细胞与SP_2/o骨髓瘤细胞融合,采用Dot-ELISA和间接ELISA法筛选出7株分泌针对伊氏锥虫的单克隆抗体的杂交瘤株(IH_(10)、AE_7、EB_6、BE_5、AG_(11)、BA_5、GB_6),实验结果表明,间接ELISA和Dot-ELISA符合率良好。分泌的7种克隆抗体有5株属于IgG_1,2株属于IgG_(2a);用阴性血清封闭试验及交互抑制试验证实7株单抗都是针对伊氏锥虫的,并证明是针对不同决定簇的。     

应用反向间接血凝(抑制)试验检测伪狂犬病

目前,对伪狂犬病的诊断方法主要为间接血凝(IHA)试验(潘乃珍等,1990;Hap-per等,1980),酶联免疫吸附试验(ELISA)(蒋玉雯,1988)和斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)(李克荣,1989)。有关反向间接血凝试验(RPHA)和反向间接血凝抑制试验(RPHI)在伪狂犬病诊断中的应用尚未见报道。现将应用单克隆抗体Mab_3致敏的绵羊红细胞(SRC_3)快速诊断伪狂犬病病毒(PRV)抗原和抗体的研究结果,报告如下。     

住肉孢子虫病免疫学诊断方法的研究

本文以间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体试验(IFA)、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)等4种免疫方法诊断水牛、黄牛和猪的住肉孢子虫病,检出率分别为77.6％(其中水牛为93.4％,黄牛为65.9％),96.1％(其中猪为59.2％,小牛及青年牛为71.4％,成年牛为97.5％),97.5％和97.8％。其中应用IFA、Dot-ELISA诊断家畜住肉孢子虫病,在国内尚未见有报道。试验表明,免疫学诊断技术是当前对家畜住肉孢子虫病进行生前诊断的主要方法。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

采用超声裂解的副猪嗜血杆菌菌体上清作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法.通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度80μg/mL;37℃作用2 h后4℃过夜包被,待检血清的稀释度为1:320,抗原抗体反应时间为1 h,酶标二抗稀释度为1:15 000,作用时间为1 h,底物显色时间为15 min.待检血清S/N值≥2.5时判为阳性,S/N值<2.5时判为阴性.特异性、重复性和敏感性试验以及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法的特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查.     

禽流感病毒NS1抗体间接阻断ELISA检测方法的建立

以禽流感病毒(AIV)重组NS1蛋白作为检测抗原,兔抗NS1血清为阻断抗体,建立了检测AIVNS1抗体的间接阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原的最佳包被浓度为0.6 tμg/mL,阻断抗体的最佳稀释度为1:10 000,待检血清最佳稀释度为1:10.用该方法对42份AIV感染禽类血清样本和50份用AIV灭活疫苗免疫的禽类血清样本进行检测,结果显示,该方法的敏感性为95.2%,特异性为90.0%.交叉反应试验证明,该方法与新城疫等8种其他禽病阳性血清不发生交叉反应.临床检测结果显示,185份AIV灭活疫苗免疫禽血清样本的阴性率为89.2%,20份基因工程疫苗免疫禽血清样本的阴性率为95.0%,42份健康非免疫禽血清样本的阴性率为100%.表明,建立的间接阻断ELISA方法可用于区分AIV自然感染禽和疫苗免疫禽.     

应用间接ELISA检测微小隐孢子虫抗体的研究

以在大肠埃希氏菌中表达的微小隐孢子虫 (Cryptosporidum parvum )子孢子表面抗原CP15为抗原 ,以辣根过氧化物酶 (HRP)标记的山羊抗鼠IgG为二抗 ,建立了检测微小隐孢子虫抗体的间接ELISA。试验筛选出的最佳反应条件为 :大肠埃希氏菌CP15抗原包被量为 1μg/孔 ,用10 0mL/L的兔血清进行封闭 ,以正常大肠埃希氏菌裂解上清液稀释待检血清。试验结果表明 ,应用CP15重组蛋白作为诊断微小隐孢子虫抗体的抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点     

抗鹅细小病毒卵黄IgG的制备及其间接ELISA检测方法的建立

采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提与DEAE50纤维素层析相结合的方法从免疫鹅细小病毒(GPV)的鹅卵内提取鹅卵黄IgG,通过核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG的浓度和纯度后,制备兔抗鹅IgG酶标抗体;建立了针对GPV的间接ELISA抗体检测方法,确定其最佳工作条件,并对该ELISA的特异性及重复性进行检测;应用该间接ELISA检测了GPV VP3基因疫苗的免疫效果。结果显示,获得的纯化鹅卵黄IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度达到94.5%,兔抗鹅IgG的血清琼脂扩散效价约为1∶32;经筛选确定该ELISA的最佳工作条件为:最适抗原包被浓度为20μg/mL,最适血清稀释度为1∶100,酶标抗体的最佳工作浓度为1∶3 000。用建立的间接ELISA检测禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒的阳性血清均为阴性,表明该方法特异性强、重复性好。经临床初步应用,能检出GPV VP3基因疫苗产生的抗体,在肌肉注射100μg与200μg基因疫苗的鹅血清中,IgG均从第14天开始上升,并分别在第35、21天达到最大值。表明本试验制备的兔抗鹅IgG酶标抗体具有较好的应用价值。     

用Dot-ELISA快速检测绵羊种布氏菌病

将斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)用于检测绵羊布氏菌(Brovis)感染并和常规ELISA、R-SAT、R-Coombs进行比较。结果在150份血清标本中Dot-ELISA的检出率为65.3％;ELISA 64.0％;R-SAT 38.6％;R-Coombs52.7％。并用50份S型布氏菌阳性血清和8份TB阳性血清进行了Dot-ELISA试验,结果全部阴性,未发生交叉反应。3次重复试验结果一致。结果证明本方法敏感性高,特异性强,操作简便快速,易于基层推广使用。