副鸡嗜血杆菌基因文库的构建与筛选

为了筛选副鸡嗜血杆菌的体内表达基因,提取了副鸡嗜血杆菌的全基因组,构建了副鸡嗜血杆菌基因组的pET系统表达文库。运用PCR及核酸内切酶(SalⅠ+NdeⅠ)鉴定基因文库,并以病原菌吸附后的康复血清作为探针,采用菌落原位杂交的方法对基因文库进行筛选。结果显示,重组质粒中有0.5～2kb的片段插入,99%的基因包含在基因文库中;重复筛选后得到的阳性克隆再经过PCR与SalⅠ+NdeⅠ酶切鉴定后定向测序,并对测序结果在NCBI上进行分析后发现筛选获得的基因中,有1个表达为转运谷氨酰还原酶、1个表达为转录终止因子,1个表达为荚膜合成域2,还有2个表达为保守假想蛋白。结果表明,本研究应用体内诱导抗原技术(IVIAT)筛选到了一些副鸡嗜血杆菌体内诱导表达基因,并对基因的功能做了初步探讨,在找寻副鸡嗜血杆菌在体内生存以及致病关键基因的道路上前进了一步,为传染性鼻炎的预防和治疗积累了有价值的资料。     

胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因的筛选

利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌(APP)体内表达的基因进行了初步筛选.将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合,分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21(DE3)的全菌及全菌裂解物进行吸附,用ELISA方法检测吸附效果,经吸附后血清D450nm分别由原来的0.927和0.239降低为0.196和0.078.同时,将APP1基因组DNA以Bsp143 Ⅰ进行酶切,回收500～2000 bp的片段,与pET30a/b/c载体连接,构建了APP1基因组质粒表达文库,库容量(CFU)为2.0×105.用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交筛选该基因组表达文库,从3 000个菌落中获得了12个阳性克隆.     

副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的原核表达与鉴定

为获得副猪嗜血杆菌(HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物,根据GenBank发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成1对特异性引物,以HPS血清13型安徽分离株(LJ3)的基因组DNA为模板,利用PCR扩增tbpA基因,然后将其克隆至pET-SUMO载体,构建重组原核表达质粒pET-SUMO-tbpA,通过PCR鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,并进行IPTG诱导表达和His-Ni-resin纯化目的蛋白。经SDS-PAGE检测,获得了110ku的表达产物,与预期大小的转铁结合蛋白A(TbpA)的分子质量一致。Western-blot分析表明,表达产物与HPS阳性血清能发生反应,显示表达产物具有良好的免疫活性。结果表明,成功表达的TbpA为研制HPS新型疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

采用超声裂解的副猪嗜血杆菌菌体上清作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法.通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度80μg/mL;37℃作用2 h后4℃过夜包被,待检血清的稀释度为1:320,抗原抗体反应时间为1 h,酶标二抗稀释度为1:15 000,作用时间为1 h,底物显色时间为15 min.待检血清S/N值≥2.5时判为阳性,S/N值<2.5时判为阴性.特异性、重复性和敏感性试验以及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法的特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查.     

浙江省副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

从浙江省5个县(区、市)疑似患有多发性浆膜炎和关节炎猪的98份病料中分离到26株细菌,通过细菌形态、培养特性和生化特性观察以及PCR鉴定最终确定为副猪嗜血杆菌。对26株已确定为副猪嗜血杆菌的分离株进行了血清学分型和药敏试验。结果显示,分离到的26株副猪嗜血杆菌分离株中,4型8株,5型6株,12型5株,13型2株,其余5株无法分型,并且副猪嗜血杆菌对头孢类药物、氟喹诺酮类药物及庆大霉素敏感,对复方磺胺类药物、大环内酯类抗生素及氯霉素敏感性略有不同,对四环素、氨苄青霉素具有耐药性。试验结果对浙江省猪场副猪嗜血杆菌病的防治提供了指导依据。     

副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的构建及鉴定

为构建副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株,本研究通过重叠PCR构建了galE基因的上、下游同源臂,然后将其连接到pRE112载体而构建了重组自杀性质粒pRE112ΔgalE;使重组质粒pRE112ΔgalE转化大肠杆菌X7213,与副猪嗜血杆菌接合转移,应用两步法筛选galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE,用PCR方法验证galE基因的缺失突变。在此基础上进一步研究galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的生长特性、药物敏感性、对保育猪的毒力等生物学特性。结果,副猪嗜血杆菌血清5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE构建成功,且缺失株的毒力已经被致弱,对药物的敏感性增加。本试验的研究结果为研制更加安全的副猪嗜血杆菌弱毒疫苗提供了实验材料。     

致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86 fedA基因的克隆与原核表达

以致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86的基因组DNA为模板,对去掉信号肽的456bp的fe-dA基因进行了PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ与EcoRⅠ位点之间,经酶切鉴定与测序,在大肠杆菌中以IPTG诱导表达,并对表达产物用SDS-PAGE和Western-blot分析进行验证。结果表明,筛选出的阳性质粒pGEX-fedA-2(pfedA)经测序并与GenBank中收录的M61713序列进行比较,证明插入序列及读码框正确;表达产物GST-FedA经SDS-PAGE分析大小约42.4ku,Western-blot分析证实其具有良好的反应原性。所构建的原核表达载体可大量表达抗原蛋白,为进一步研究猪水肿病亚单位疫苗奠定了基础。     

狐源维氏气单胞菌体内诱导基因的筛选

为了筛选狐源维氏气单胞菌体内诱导基因,本研究将狐源维氏气单胞菌人工感染家兔,并取不同感染时期的血清混合,分别用体外培养的维氏气单胞菌和大肠杆菌BL21全菌、二者菌体裂解物以及热变性裂解物进行吸附,用ELISA进行检测;同时构建狐源维氏气单胞菌基因组的p ET系统重组质粒表达文库。再用经吸附处理的血清对狐源维氏气单胞菌基因组文库进行菌落原位免疫杂交筛选,将筛选的阳性克隆进行测序,并用RT-PCR进一步验证。结果显示,最终获得8个狐源维氏气单胞菌的体内诱导基因,分别为GTP焦磷酸激酶基因、转录调控基因Mar R基因、氢化酶细胞膜亚基基因、外膜受体转运蛋白Ton B基因、Ⅲ型分泌系统asc V基因以及3个保守假想蛋白基因。研究结果为维氏气单胞菌保护性抗原的筛选、分子致病机制及跨物种间传播机制奠定了基础。     

刚地弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达

采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.将重组质粒转染BHK-21细胞.间接免疫荧光染色证明,质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达.Western-blot分析证实,细胞裂解液及上清样品中有1条约39.2 ku的条带,可被山羊抗刚地弓形虫超免疫血清所识别,大小与预测值相符.表明,真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性.     

副猪嗜血杆菌不同血清型稳定表达蛋白的筛选及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种能够检测不同血清型副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA,选用了在4、5、12型副猪嗜血杆菌中稳定表达的3种蛋白经原核表达后作为候选抗原和全菌裂解物同时包被酶标板,对临床猪血清进行副猪嗜血杆菌抗体检测,发现以锰依赖的超氧化物歧化酶(MSD)作为包被抗原得到的结果最接近用副猪嗜血杆菌全菌裂解物进行ELISA检测的结果,故确定以MSD蛋白为抗原建立间接ELISA。通过方阵滴定对ELISA反应条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:包被抗原的质量浓度为1.5μg/mL,4℃过夜;50g/L脱脂奶粉溶液37℃封闭2h;血清稀释度1∶160,37℃作用90min;酶标二抗的稀释度为1∶15 000,37℃作用45min;底物显色时间为37℃6min。抗体临界值D450nm≥0.245 1判为阳性,D450nm0.208 3判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、红斑丹毒丝菌、马链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。用建立的间接ELISA对114份临床血清进行检测,与4、5、12型全菌裂解物的ELISA检测结果比较,阳性符合率分别为80.77%、80.00%和90.00%。结果表明,建立的间接ELISA可被用于4、5、12型副猪嗜血杆菌的抗体检测和流行病学调查。     

原位反转录PCR技术的应用

针对已有资料中对于以DNA为靶基因序列的原位 PCR介绍较多,而对于原位反转录PCR的介绍很少,但在实际研究工作中有很多检测的靶基因是 RNA(病毒的或基因组的 RNA)的实际情况,就原位反转录PCR技术的基本原理、影响试验结果的关键因素和步骤,如组织细胞的固定、引物和探针的选择、蛋白酶及DNA酶消化、假阳性及假阴性的产生等进行了概述,旨在通过探讨上述问题,对该技术的实际应用有所指导。     

蛋鸡血清与卵黄中禽流感病毒抗体的相关性

用禽流感 (AI)H9N2油乳剂灭活疫苗免疫非免疫蛋鸡 ,并于免疫后第 0、3、5、7、9、11、13、15、17、19、2 1、30d分别测定血清及卵黄中的AI血凝抑制试验 (HI)及琼脂扩散凝集试验(AGP)抗体。结果显示 ,免疫后第 7d卵黄中即可检出HI及AGP抗体 ,以后逐渐上升 ,在免疫后第 19～ 2 1d达高峰值 ,与血清的HI抗体水平接近 ,差异不显著 (P >0 .0 5 )。表明通过对鸡蛋卵黄AIV抗体检测 ,可以进行AI的疫情监测 ,但卵黄抗体检测具有一定的滞后性     

韩国-东盟服务贸易的发展与自由化

2007年11月，韩国与东盟正式签署了《韩国-东盟全面经济合作构架下服务贸易协议》，这是继《中国-东盟服务贸易协议》之后东盟签署的第二份服务贸易协议。本文拟论述韩国与东盟国家服务贸易的发展水平和国际竞争力的特点，并分析韩国与东盟区域服务贸易自由化的特点和前景。     

从明朝北京城和阮朝顺化城看中越建筑文化交流

古代中越两国建筑文化交流十分密切。据历史记载,交趾人阮安参与了明初北京城的设计营建。而越南阮朝都城顺化则仿效明清北京城而建,顺化城中京城、皇城和紫禁城三重结构和中轴对称布局等一如北京城,甚至连建筑名称都一模一样。     

Addressing the Allied POW Issue in Japan: The Case of POW Research Network Japan

Since the mid-1990s the Japanese government has pursued reconciliation initiatives aimed at fostering understanding between Japan and former POWs. Nevertheless, the POW issue remains relatively unknown in Japan. This article describes the profile and activities of the POW Research Network Japan (POW kenkyūkai), a civil society group consisting of professional and shimin (citizen/non-professional) researchers as well as concerned citizens investigating the subject of Allied POWs in Japan. The article explores how POWRNJ participated in and contributed to the contestation of memory of the Asia-Pacific War (1931–1945) during the last decade. It describes the manner in which the group promoted its views and strived to achieve its goals. On the basis of these findings, the article identifies the kind of roles the group played, and how it mattered in the debates on Japan's wartime past.     

Non-verbal and paralinguistic political communication in sport: an analysis of images of Springbok rugby

Non-verbal communication as a subfield of communication sciences has received increased attention in scholarly publications over the past few decades. Various scholars in the field, such as Real (1975), Ekman (1993), Lunenburg (2010), Garber (2011) and Krauss, Chen and Chawla (2015), emphasise the importance of non-verbal communication in generating, processing and channelling information. Not only facial expressions but also gestures and body language are deemed important. Studies by Real (1975) found that sport plays a crucial role in identity formation and the transmission of meaning and values. In South African sport, rugby-football in particular was used to reflect Afrikaner political prowess and masculinity, and the Afrikaner’s growing influence and dominance. As Salah, Sebe and Gevers (2012) indicate, non-verbal communication should be studied within the context that frames such communication; therefore, their multi-modal approach, used in conjunction with non-verbal communication, is vital for this discussion. In this article, the broader, more inclusive contextual approaches of Salah, Sebe and Gevers (2012) and Lunenburg (2010) are employed to analyse seven iconic photographic images which are steeped in the political dynamics of the period. After focusing on the theoretical aspects of non-verbal communication underpinning the study, the photographs are analysed as examples of impactful non-verbal communication.     

Dandelions dancing in the snow

Abstract: This article is a translation of the keynote address delivered at the ‘Relire Kawabata au 21e siècle – modernisme et japonisme au-delà des mythes’ conference hosted by the Maison de la culture du Japon (Paris) and Université Paris Diderot-Paris 7 on 17–18 September 2014. It situates Kawabata Yasunari's late unfinished novel Tanpopo (Dandelions) within Japanese modernity and literary history, in particular drawing an array of connections between the work and the history of the rural northern mountain country of Japan.     

中菲南海争端仲裁庭的法律问题

菲律宾无视它与中国之间《南海各方行为宣言》的存在与有效性,以变相的岛礁主权争端和海洋划界争端的方式,单方面提起南海争端强制仲裁。虽然此举不符合《联合国海洋法公约》（以下简称《公约》）规定的条件,但并不意味着菲律宾启动该程序具有非法性。即使中国不接受该仲裁和不参与仲裁程序,也不影响中菲仲裁庭的合法成立及其程序的合法性与对中国不利裁决的有效性。因此,对待仲裁庭的后续书面程序和口诉程序,中国是维持现行政策还是重新参与,是值得重新评估的一个问题。重新参与后续程序应该是中国的一个适当政策选择。因为参与所面临的最大挑战——南海“断续线”的法律地位——可以通过反驳《公约》对之不适用从而避免澄清其地位的棘手问题。更重要的是,依据“南方蓝鳍金枪鱼案”仲裁庭的推理与裁决和中国2006年声明以及国际海洋划界与外大陆架划界案例,《南海各方行为宣言》属于《公约》第281条第1款中排除附件7强制仲裁的“协议”,菲律宾的大部分实体请求属于不可裁决事项,因而仲裁庭应该裁定对本争端无管辖权或不可受理。即使中国继续奉行不参与政策,也不应该无所作为。中国可以采取“间接参与”的方式,在仲裁庭开始书面程序后,公开发表一份正式书面文件,以全面反对菲律宾提起仲裁和反对仲裁庭对争端的管辖权和可受理性。     

2009～2010年中国-东盟货物贸易数量分析与预测——中国-东盟区域贸易数量分析年度报告之七

2009年中国-东盟贸易出现了1999年以来的首次负增长，但在第四季度双方贸易开始复苏，特别是最后两个月均出现了30％以上的增速。按国别看，本年中国与文莱及除柬埔寨之外的3个东盟新成员国的贸易增幅为正，其中，中越贸易增势突出，2009年越南超过菲律宾成为中国的第20大贸易伙伴，而中国与其余东盟6国的贸易都比2008年下滑。用Eviews检验分析显示，中、关、日、韩与东盟的贸易具有协整关系，相互关联。结合定性分析与数学模型，预测2010年的中国－东盟经贸合作将保持较高的增长势头。     

新罗宾贡生的汉诗与唐代格律诗

朝鲜从初唐时期开始就通过新罗宾贡生接受了中国格律诗的影响。其诗作集中表现了感时伤事、思乡、惜别、人生无常的情感;讲求押韵、平仄、对仗,同时用典灵活自然,注重运用隐喻手法;另外,其诗作深受晚唐唯美主义诗风的影响,但崔致远和朴仁范则体现出淡雅、通俗直白、叙事与议论相结合的现实主义诗风。