不同浓度脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞对NF-κB及LAP表达的影响

为了观察不同浓度脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞NF-κB及LAP基因表达的影响,设置不同浓度(0、50、100、200、400和800ng/mL)的脂多糖(LPS)刺激奶牛乳腺上皮细胞,分别于刺激2、4、8、16、24、48和72h后提取细胞总RNA,经反转录反应后,运用荧光定量PCR方法检测NF-κB P65亚单位和LAP的表达水平。结果,与空白对照组相比,脂多糖浓度达到400ng/mL并培养72h后,奶牛乳腺上皮细胞NF-κB P65亚单位和LAP的表达量最高,且与对照组有极显著差异(P<0.01)。结果表明,在脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性效应中,NF-κB的表达活性增强,调控着防御基因LAP表达,呈现一定的剂量和时间效应关系。     

胸腺九肽对鸡脾淋巴细胞增殖转化及IL-2基因表达与分泌的影响

采用MTT比色法、相对半定量RT-PCR法和放射免疫测定(RIA)法研究了不同浓度的胸腺九肽对离体培养的鸡脾淋巴细胞增殖转化I、L-2基因表达与分泌的影响。结果表明,用10 ng/mL和1 ng/mL胸腺九肽处理鸡脾淋巴细胞8 h后,能显著增加由ConA诱导的淋巴细胞增殖转化反应,显著提高IL-2基因的表达水平以及细胞培养上清液中的IL-2含量(P<0.05);100 ng/mL的胸腺九肽虽有增强脾淋巴细胞增殖转化反应以及提高IL-2基因表达和分泌能力的趋势,但与对照组无显著差异(P>0.05)。提示,胸腺九肽能增强鸡脾淋巴细胞的增殖转化反应,并主要在基因转录水平上促进IL-2的合成与分泌,其作用与剂量大小有关。     

大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1和NF-κB及TLR4表达的影响

为研究大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)TGF-β1表达的影响以及对其信号转导通路Toll样受体4(TLR4)的表达和核转录因子κB(NF-κB)活化的影响,采用热灭活的不同浓度大肠杆菌菌液(0、1×105、1×106、1×108 CFU/mL)作用于奶牛乳腺成纤维细胞,分别于不同时间点(作用后第6、12、24、48小时)运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TGF-β1和TLR4mRNA的表达,运用Western-blot检测TGF-β1、TLR4和p-NF-κB-p65蛋白的相对表达量。结果显示,大肠杆菌作用BMFB后,TGF-β1mRNA和蛋白的表达量显著的升高,并且TGF-β1mRNA的表达呈明显的时效及量效关系,于第24小时达到高峰后降低(P0.05);TGF-β1蛋白的表达量呈量效性(P0.05)。TLR4mRNA和蛋白表达水平显著升高,并且TLR4mRNA和蛋白的表达呈时效性和量效性,分别于作用后第24和12小时达到最高后逐渐下降(P0.05)。p-NF-κB-p65的表达与大肠杆菌作用浓度呈正量效关系,表达量随作用时间延长先升高后逐渐降低(P0.05)。上述研究结果表明,热灭活的大肠杆菌能够促进BMFB的TLR4表达,并激活BMFB p-NF-κB-p65蛋白的表达,从而促进TGF-β1的表达。     

IGF-I和EGF对牦牛乳腺上皮细胞SND1表达的影响

本研究旨在研究不同浓度胰岛素样生长因子I(IG F-I)和表皮生长因子(EGF)对牦牛乳腺上皮细胞SDN1(金黄色葡萄球菌核酸样都铎域1)表达的影响。选取纯化的第3代牦牛乳腺上皮细胞,分别加入0、50、100、200 ng/m L IGF-I或EGF,通过实时荧光定量PCR和免疫荧光检测它们对SND1基因表达及表达蛋白分布的影响。实时荧光定量PCR和免疫荧光分析显示:IGF-I可提高牦牛乳腺上皮细胞SND1基因的表达,且具有浓度依赖性,当IGF-I浓度为200 ng/m L时,SND1基因的白表达量最高,显著高于其他浓度组(P0.05);EGF也可提高SND1基因的表达,当EGF浓度为100 ng/m L时,SND1基因和的表达量最高,显著高于其他浓度组(P0.05)。SND1蛋白主要分布于牦牛乳腺上皮细胞胞核中。研究结果表明,IGF-I、EGF可通过调控牦牛乳腺上皮细胞SND1的表达来调节泌乳机能。     

猪链球菌2型39ku胞壁蛋白诱导巨噬细胞凋亡的研究

为探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)的39ku胞壁蛋白对巨噬细胞的致病作用,将39ku胞壁蛋白纯化,取小鼠腹腔巨噬细胞(murine peritoneal macrophage,MPM)和39ku胞壁蛋白(4μg/mL和40μg/mL)共孵育,用荧光显微镜观察细胞的形态学变化,以不同浓度(4～50μg/mL)39ku胞壁蛋白腹腔注射小鼠,作用6h,用DNA Ladder法检测MPM凋亡情况,以40μg/mL腹腔注射,分别作用2、4、6、8h,用流式细胞术检测MPM凋亡率,同时用试剂盒比色法检测其Caspase 3的表达动态。结果显示,低浓度(4μg/mL)诱导后MPM未见异常形态改变;而高浓度(40μg/mL)能引起典型的凋亡形态学变化,低浓度(4μg/mL)诱导后,DNA图谱与阴性对照相同;而高浓度(20～50μg/mL)诱导后均出现典型的DNALadder,且随39ku胞壁蛋白浓度增加,梯状条带更加清晰。流式细胞分析表明,MPM的凋亡率随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而增加,与对照组之间均差异极显著(P<0.01);Caspase 3的表达量随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而上升,各时间点之间均差异显著(P<0.05)。结果表明,39ku胞壁蛋白可以诱导MPM高水平凋亡,凋亡率与39ku胞壁蛋白的作用浓度和时间之间正相关,39ku胞壁蛋白可单独作为SS2的毒力因子。     

TGF-β1对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA表达的影响

为研究外源性TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞表达CTGF mRNA的影响,用组织块法体外培养和纯化出奶牛乳腺上皮细胞,并应用免疫组织化学的方法鉴定细胞的纯度。然后用不同浓度的外源性TGF-β1(0,1,5,10ng/mL)作用乳腺上皮细胞,作用12,24,48,72h后分别提取细胞的总RNA,以β-actin作为内参基因,用实时荧光定量RT-PCR方法测定CTGF mRNA相对表达量的变化,并对CTGF的PCR产物进行测序分析。结果显示,TGF-β1处理组(1,5,10ng/mL)较对照组(0ng/mL)差异显著(P<0.05);处理组CTGF mRNA的相对表达量显著升高,并呈正量效关系:随着TGF-β1浓度的升高,CTGF mRNA的相对表达量基本呈逐渐升高的趋势。测序分析结果证明扩增产物为牛的CTGF基因序列,表明外源性TGF-β1可显著促进奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA的表达,进而在奶牛乳腺纤维化过程中发挥作用。     

新型鸭呼肠孤病毒TH11株在BHK21细胞系中的增殖特性

为研究新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)在BHK21细胞系中的增殖规律,将NDRV野毒株TH11接种BHK21细胞系,连续传代3次后,观察病毒对细胞的致病变效应(CPE),并对病毒核酸及其蛋白的表达和病毒增殖特性进行了鉴定。结果显示,NDRV TH11株能够在BHK21细胞中有效增殖,并产生以细胞巨融合为主的典型CPE,病毒蛋白在细胞中也获得了良好表达,并与σC蛋白特异性抗体发生反应。一步生长曲线显示,TH11毒株感染BHK21细胞后第0~12小时为潜伏期,第12小时开始增殖,第12~36小时进入快速增殖期,第48小时病毒效价即达到最高,即TCID50为106.57/0.1mL,随后病毒的增殖随细胞的崩解而降低。上述结果为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞灭活疫苗奠定了基础。     

旋毛虫ES抗原对小鼠巨噬细胞TLR2/4mRNA表达的影响

为探讨旋毛虫ES抗原对RAW264.7细胞TLR2/4mRNA表达的影响,分别取经0、2、5、15、30、45μg/mL ES抗原作用24h的RAW264.7细胞和用15μg/mL ES抗原作用0、3、6、12、18、24h后的RAW264.7细胞,采用半定量PCR方法检测TLR2和TLR4mRNA的表达水平变化。结果显示,随着ES抗原浓度的升高,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,15μg/mL ES抗原组与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。在15μg/mL ES抗原作用24h内,随着作用时间的延长,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,作用18h后的表达水平升高,且与空白对照组差异显著(P<0.05)。证实,ES抗原可刺激RAW264.7细胞表面受体TLR2/4表达升高,且存在一定的剂量和时间效应。     

重组猪α干扰素的纯化及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制作用

建立重组猪α干扰素(rPoIFN-α)的毕赤酵母分泌表达工艺,甲醇诱导84 h时,rPoIFN-α的表达量最高,达650.3 g/mL。随后,依次采用亲和、离子交换、分子筛层析对获得的rPoIFN-α进行纯化,得到纯度为95%的rPoIFN-α,生物活性为5.63×106IU/mg。细胞病变抑制结果表明,以341 IU/mL的rPoIFN-α预处理Marc145,可以完全抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的增殖;在PRRSV感染后的24 h,1 367IU/mL的rPoIFN-α可以完全抑制PRRSV的增殖。结果表明,获得的rPoIFN-α可有效抑制PRRSV的增殖,为rPoIFN-α的临床应用奠定了科研基础。     

马急性滑膜炎模型关节液中MMP-2和MMP-9质量浓度变化的研究

为探索基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在马急性滑膜炎模型中的作用,选用13匹蒙古马,将其随机分为试验组(n=8)和对照组(n=5)。在试验组马右侧腕关节内注入0.5ng/mL大肠杆菌脂多糖1mL,建立马滑膜炎模型;在对照组马右侧腕关节注射1mL磷酸盐缓冲液。注射后第0、8、24和168小时各采集关节液1次,用ELISA检测马关节液中MMP-2和MMP-9的质量浓度。结果显示,试验组马在注射后第8小时关节液中MMP-2、MMP-9质量浓度显著增加并达到最高,分别为18.05ng/mL±0.49ng/mL和19.64ng/mL±0.59ng/mL,与对照组比较差异显著。注射后第24小时MMP-2、MMP-9质量浓度下降,第168小时质量浓度恢复到对照组水平。结果表明,MMP-2和MMP-9在滑膜炎的急性期起到重要作用;MMP-2和MMP-9可以作为检测马滑膜炎的指标。     

褪黑激素对犬脂肪干细胞向雪旺细胞分化过程中凋亡发生的抑制作用研究

为了探讨褪黑激素(Mel)对犬脂肪干细胞(ADSCs)向雪旺细胞(SCs)诱导分化过程中凋亡发生的影响。本实验将犬ADSCs诱导分化为SCs,并使用免疫荧光法进行鉴定。采用CCK8法选取Mel的最佳浓度。应用q RT-PCR法和Western-blot法检测无Mel组和Mel处理组中ADSCs向SCs诱导过程中细胞凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2和Bax的m RNA和蛋白表达水平。结果显示,50 nmol/L Mel处理过的细胞活力最高;ADSCs向SCs诱导后S-100和GFAP呈阳性表达,并且观察到Mel的添加并不会影响到SCs的表型特征。ADSCs向SCs诱导后Bcl-2表达量明显低于对照组,Caspase-3、Caspase-8和Bax的表达量显著高于对照组,细胞凋亡较多;在加入Mel后Bcl-2表达量显著升高,Caspase-3、Caspase-8和Bax的表达量显著下降。结果说明Mel可以显著抑制犬ADSCs向SCs诱导分化过程中的凋亡发生。     

鹅细小病毒VP3基因疫苗两种不同免疫方式对细胞免疫的影响

将构建的鹅细小病毒(GPV)VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)转染鹅胚成纤维细胞(GEF),每隔12 h检测VP3蛋白的表达情况,同时以不同剂量分别通过基因枪轰击和肌肉注射免疫28日龄健康雏鹅,于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77和105 d采血,进行淋巴细胞增殖试验(MTT法)。结果,转染后第24 h即可在GEF中检测到GPV VP3蛋白,第60 h表达量达到高峰。试验组鹅外周血T淋巴细胞D490 nm值在免疫后第35 d达到最大。肌肉注射组和基因枪组免疫后第14~63 d、第7~63 d的D490 nm值分别与PBS对照组差异极显著;肌肉注射组及基因枪组免疫后第21~49 d的D490 nm值显著高于弱毒疫苗对照组;肌肉注射组及基因枪组免疫后第14~63 d的D490 nm值极显著高于空质粒对照组。表明,基因枪轰击和肌肉注射pcDNA-GPV-VP3均能诱导雏鹅产生良好的细胞免疫应答。     

猪瘟病毒E_2基因疫苗表达抗原在小白鼠胫前肌的分布及消长

用免疫组化法检测了猪瘟病毒（ＨＣＶ）Ｅ２囊膜糖蛋白基因疫苗表达的抗原在小白鼠胫前肌中的分布及消长。结果：ＨＣＶＥ２基因疫苗ｐＣＤＳＴ接种小白鼠胫前肌后,表达的Ｅ２抗原主要分布于肌纤维膜上,少量分布于肌纤维间,在细胞浆中很难检测到Ｅ２抗原;用ＨＣＶ基因疫苗免疫后１ｄ,Ｅ２抗原已有表达,１３ｄ抗原达高峰,以后逐渐减少,３０ｄ仅检测到少量抗原。     

鸡胚胎腺垂体卵泡刺激素细胞的发育及其变化

应用免疫组织化学方法,对发育的第3.5～20.5天鸡胚腺垂体卵泡刺激素(FSH)细胞的发生及其在发育过程中的变化规律进行了研究。结果,鸡胚发育的中期(第10.5天),可观察到少量明显的FSH细胞分布于腺垂体后叶,随着胚胎的发育,FSH细胞数量显著增加(P<0.05),发育的第16.5天FSH细胞数量增加到了整个孵化期的最大值,分布于垂体后叶的腹侧,前叶仅有少量零散的FSH细胞;在发育的第18.5天至出生期FSH细胞数量显著减少。早期FSH细胞体积小、细胞浆少、细胞核大,单个或团状分布,随着胚龄的增加,细胞体积增大、细胞浆增多、细胞浆浓染。结果表明,鸡胚胎腺垂体FSH细胞发生于胚胎发育的中期,细胞的增殖和分化过程发生在胚胎发育的中后期;FSH细胞分布于垂体后叶腹侧。     

Prohibitin 2基因参与猪圆环病毒2型PK-15细胞感染的研究

为探究Prohibitin2(PHB2)在PCV2感染细胞过程中发挥的作用,首先通过间接免疫荧光试验检测PCV2在PK-15细胞中的增殖变化,同时建立PHB2荧光定量PCR检测体系,然后以PCV2已知的宿主细胞互作蛋白gC1qR为对照,检测PCV2感染PK-15细胞后PHB2 mRNA的动态变化,最后鉴定PHB2 siRNA转染PK-15细胞中PCV2 Cap的表达。结果表明,PHB2在正常及PCV2感染的PK-15细胞中均有效表达。随着PCV2感染PK-15细胞,gC1qR转录水平在病毒感染3 h显著降低,感染6 h时升高,随后(12~48 hpi)转录水平下降;而PHB2转录水平在PCV2感染6 h内显著升高,随后(12~48 hpi)mRNA水平有所下降;RNA干扰PHB2对PCV2在PK-15细胞中复制起到显著的抑制作用。上述研究结果表明,PCV2可显著影响PK-15细胞中PHB2转录,而且PHB2对PCV2病毒复制具有调节作用。     

旋毛虫感染小鼠后TNF-α诱导心肌细胞凋亡的试验观察

为探讨旋毛虫致小鼠心肌损伤发生的主要致病因子及其信号传导途径,分别取感染前后不同时期小鼠心肌,应用半定量RT-PCR法检测心肌中炎性细胞因子TNF-α及细胞凋亡与抗凋亡基因mRNA表达量,并应用TUNEL法对心肌细胞凋亡形态进行了检测。结果显示,旋毛虫感染后第9天,TNF-αmRNA的相对表达量由感染前的0.02迅速增加到0.88,心肌细胞凋亡增加,凋亡指数为10.70%;TNF-α表达量约于感染后第19～24天达到峰值,此时凋亡指数达29.79%,细胞凋亡明显(P<0.05);第42天TNF-α表达量逐渐下降至0.29,细胞凋亡逐渐减少,凋亡指数降至10.46%。TNFR 1、FADD、Caspase 8和Caspase 3mRNA的相对表达量的变化趋势与TNF-α相似。     

乳腺炎大鼠肾组织中P物质的表达与肥大细胞的形态学观察

应用组织化学和免疫组织化学方法对正常及攻毒不同时相组大鼠肾组织肥大细胞的数量、活性、分布范型、组织化学性质的动态变化及P物质的表达水平进行了研究。结果显示,攻毒后第6 h炎性细胞开始浸染肾小管基膜、肾小囊壁层及肾小球,12 h后浸染程度开始减少,第24 h出现最低值,而后又开始增多,至第72 h浸染达到高峰。且此间质内血管出现轻微的裂隙。同时不同时相肾组织的肥大细胞及其脱颗粒数量和P物质的表达水平均与炎性细胞浸染变化相吻合,攻毒后第6、12、48、72 h的炎性细胞、肥大细胞及其脱颗粒数量均显著高于攻毒前(P<0.05),且在攻毒后第72 h均达到最高值;P物质的表达与肥大细胞相关联。证实,肥大细胞和P物质参与了乳腺炎所致肾组织损伤与肾功能衰竭的病理过程。     

鸭源新城疫强毒株对番鸭细胞因子及Toll样受体mRNA表达的影响

为研究人工感染鸭源新城疫强毒株(Md/CH/LGD/1/2005)诱导番鸭细胞因子及Toll样受体基因的表达情况,选用80只15日龄SPF番鸭,随机分为攻毒组和对照组,每组各40只,攻毒组以滴鼻点眼的方式接种1×107.0EID50鸭源基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)Md/CH/LGD/1/2005,对照组接种灭菌的磷酸盐缓冲液。分别在攻毒后36 h、72 h、7 d和25 d剖杀10只番鸭,采集每只番鸭的骨髓、脾、盲肠扁桃体、哈德氏腺和法氏囊样品,通过Real-time RT-PCR方法检测组织中NDV载量、细胞因子和Toll样受体基因的表达。结果显示,除哈德氏腺外,其余各组织中病毒含量在攻毒后72 h达到最高,对照组各组织中均未检测到病毒含量。与对照组相比,经NDV感染后,IL-1β在攻毒36 h的法氏囊和攻毒7 d的哈德氏腺中表达量显著上调(P<0.05);IL-2、IL-6、IL-18和IL-20在攻毒7 d的脾内表达显著上调(P<0.05)。TLR3、TLR15和TLR21均在法氏囊内高表达(P<0.05),且表达趋势相同,对NDV感染的应答可能具有协同效应。TLR5在骨髓、脾、盲肠扁桃体和法氏囊内显著上调(P<0.05);TLR7在攻毒7 d的骨髓和法氏囊内表达上调(P<0.05)。结果表明,感染NDV后番鸭可能通过TLR相关的信号转导通路诱导宿主免疫抗性基因的表达,调控机体的抗病毒免疫应答反应。     

牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达。提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体。     

氨基胍对内毒素血症肉鸡肝自由基损伤的影响

为了探讨自由基在肉鸡内毒素血症发病机理中的作用,将90只30日龄的肉鸡,公母各半,随机分为生理盐水对照组(A组)、内毒素注射组(B组)和氨基胍治疗组(C组),每组30只。分别在试验后第1、3、5、7和9 h每组各宰杀6只,提取肝组织,检测肝组织中的总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,内毒素血症时肝组织中SOD、GSH-Px和CAT活性降低,MDA含量明显升高,肝组织中T-AOC下降,而氨基胍治疗组的情况明显好转。证实,由自由基增多而引起的脂质过氧化损伤在肉鸡内毒素血症发病机理中起着重要的作用,氨基胍可有效降低脂质过氧化造成的损伤。