牛新孢子虫病LAMP检测方法的建立

为建立一种快捷、灵敏的牛新孢子虫病检测方法,根据GenBank上登录的新孢子虫NcSAG1基因(AF132217)序列设计合成了2对环介导等温扩增(LAMP)特异引物,建立了检测牛新孢子虫病的LAMP技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验.结果显示,LAMP方法扩增牛新孢子虫的电泳产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光,酶切鉴定出现目的条带,LAMP方法检测的敏感性为5×10~5 copies/μL;特异性试验显示,新孢子虫检测管显色后呈阳性,而瑟氏泰勒虫、弓形虫和附红细胞体等对照组均呈阴性.表明,本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛新孢子虫病的检测.     

牛新孢子虫病和弓形虫病的流行病学调查

为了调查我国牛新孢子虫和弓形虫的感染情况,应用新孢子虫酶联免疫吸附试验(ELISA)和弓形虫间接血凝试验(IAT)分别检测了来自国内10个省(市、自治区)的262份乳牛、10份肉牛和40份水牛血清。结果显示,乳牛新孢子虫的抗体阳性率为17.2%,弓形虫的抗体阳性率为2.3%,没有检测到既有新孢子虫抗体又有弓形虫抗体的乳牛血清。各牛场所检乳牛血清的新孢子虫抗体阳性率在0~34.4%之间。在水牛和肉牛血清中未检测到新孢子虫抗体和弓形虫抗体。流产乳牛血清的新孢子虫抗体阳性率为20.2%,未流产乳牛为16.1%,其中血清抗体阳性乳牛主要在妊娠中晚期流产。各个年龄段乳牛血清的抗体阳性率差异不显著(P>0.05)。不同妊娠胎次的乳牛血清抗体阳性率差异不显著(P>0.05)。确认新孢子虫病在国内大部分牛场存在。     

牦牛胎儿体内住肉孢子虫的发现

文献报道,自然感染或人工感染住肉孢子虫的牛和绵羊,可引起胎儿流产,并在牛的流产胎儿体内发现有住肉孢子虫存在,但未见有关牦牛胎儿感染住肉孢子虫的报道。本文首次报道在牦牛胎儿体内发现的住肉孢子虫,进一步证实该虫体可经胎盘     

猴源环孢子虫的分离与分子鉴定

采用饱和蔗糖漂浮法、改良抗酸染色法和孢子化试验首次从广东某猴场的猴粪中分离到疑似环孢子虫卵囊。为了对其进行分子鉴定,采用巢式PCR和普通PCR方法,针对环孢子虫属18SrDNA和ITS基因设计了3对引物,扩增其目的片段,并进行了序列分析。结果显示,卵囊大小为7.5～10μm,经改良抗酸染色的卵囊染色程度不一,孢子化卵囊内含2个孢子囊,每个孢子囊内含有2个子孢子。通过PCR扩增,获得的18SrDNA目的片段长712bp,测序结果表明该猴源环孢子虫18SrDNA基因与Cyclosporacolobi、狒狒环孢子虫、人环孢子虫的相似率较高,在进化树上位于同一分支。获得的ITS-1+片段长760bp,其中ITS-1序列高度特异,在GenBank中未见同源性序列。结果表明,从猴粪中分离的疑似环孢子虫卵囊应属于环孢子虫。     

三种致奶牛流产病原多重巢式PCR检测方法的建立

为同步检测引起奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原,本研究分别设计针对新孢子虫ITS1基因(Nc-ITS1)、布氏杆菌16S rRNA基因(Ba-16S rRNA)及弓形虫529 bp重复序列基因(Tg-529 bp)的特异性巢式PCR引物,建立并优化了能够同时检测这三种病原的多重巢式PCR方法。结果显示,多重巢式PCR对Nc-ITS1、Ba-16S rRNA及Tg-529 bp扩增产物的大小分别为601 bp、380 bp、245 bp。外引物退火温度为57℃,内引物为53℃;Taq酶、dNTP和Mg2+浓度分别为1.0 U、2.0 mmol/L和1.0 mmol/L;Nc-ITS1和Tg-529 bp外、内引物浓度均为0.4 m ol/L,Ba-16S rRNA为0.2 mol/L。该多重巢式PCR对Nc-ITS1和Ba-16S rRNA检测敏感性达3×102 copies/L,对Tg-529 bp达3×101 copies/L,对住肉孢子虫、大肠杆菌、沙门菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌扩增均无目的条带,表明该多重巢式PCR方法具有良好的敏感性和特异性。利用该方法对86份临床样品进行检测,结果显示新孢子虫阳性样品26份,布氏杆菌阳性样品2份,弓形虫阳性样品1份,其中新孢子虫和布氏杆菌均为阳性的样品1份,与单巢式PCR检测结果一致。结果表明,建立的多重巢式PCR方法可以用来对致奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原进行快速、准确地检测。     

犬新孢子虫新疆Nc-1株NcSRS2基因的克隆及原核表达

根据GenBank中犬新孢子虫NcSRS2基因序列设计了1对引物,从新孢子虫病阳性牛血液中提取总DNA,经PCR扩增NcSRS2基因,将其插入原核表达质粒pGEX-4T-2中,重组质粒pGEX-4T-NcSRS2经测序确定后,转入表达菌株BL21,优化其表达条件,并探讨了GST-NcSRS2蛋白的生物活性。结果显示,在37℃条件下,经终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导表达4h后,获得融合蛋白。Western-blot分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合,rELISA检测与弓形虫和布鲁氏菌阳性血清无交叉反应。     

枯氏肉孢子虫包囊检查方法比较

肉孢子虫是畜禽,尤其是草食兽常见的寄生原虫,广泛流行于世界各地。现已查明寄生于黄牛的肉孢子虫有3种:牛犬肉孢子虫(Sarcocystis bovicanis),又名枯氏肉孢子虫(S.cruzi);牛猫肉孢子虫(S.bovifelis),又名多毛肉孢子虫(S.hirsuta);牛人肉孢子虫(S.bovihomihis),又名人肉孢子虫(S.hominis)。这2种肉孢子虫的终末宿主各不相同,但在同一中间宿主(黄牛)的肌肉组织内均以包囊形式寄生。检查包囊的方法有旋毛虫检验法、带光源的解削镜检查法、包囊染色法(如美兰染色法、柯扎尔氏法、姬     

犬新孢子虫AMA1基因重组真核表达质粒的构建及其在Vero细胞中的表达

为构建犬新孢子虫AMA1基因的重组真核表达质粒,了解其在Vero细胞中的表达情况,采用RT-PCR方法扩增牛源犬新孢子虫吉林株AMA1全长基因,构建了重组真核表达质粒pVAX1-NcAMA1;利用脂质体介导转染法将该重组质粒转染至Vero细胞,应用间接免疫荧光方法(IFA)和Western-blot技术检测AMA1基因在Vero细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫吉林株AMA1基因的长度为1 695bp,与GenBank中相应基因序列(AB265823.1)的同源性为99.9%。成功构建了重组真核表达质粒pVAX1-NcAMA1,IFA检测发现AMA1基因在Vero细胞中获得了瞬时表达,表达产物经Western-blot鉴定,其分子质量约为68ku,且具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病核酸疫苗的进一步研究奠定了基础。     

抗贝氏隐孢子虫卵黄抗体的制备与鉴定

为分析抗贝氏隐孢子虫的免疫机制,本研究将纯化的贝氏隐孢子虫卵囊经处理后制备成免疫抗原,经鸡翅下及大腿内侧肌肉多点注射免疫6次150日龄产蛋海兰鸡,每次免疫间隔为15~20 d,以制备特异性抗贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)卵黄免疫球蛋白(IgY)。结果显示,初次免疫后第120天,IgY效价达到1∶25 600,经免疫荧光法鉴定可识别贝氏隐孢子虫卵囊。用间接ELISA和间接免疫荧光试验比较测定IgY抗体对贝氏隐孢子虫、牛安氏隐孢子虫、猪等孢球虫及猪弓形虫的抗原发现,得到的IgY抗体能特异性识别贝氏隐孢子虫。间接ELISA法测定不同温度、不同pH下IgY的活性发现,制备的IgY抗体具有较好的热稳定性和一定的耐酸、耐碱性。以上结果表明,贝氏隐孢子虫卵囊抗原免疫蛋鸡可制备高质量的特异性IgY抗体,这为进一步应用抗隐孢子虫特异性IgY抗体治疗与诊断隐孢子虫病奠定基础。     

牛源犬新孢子虫MAG1基因的克隆及原核表达

为了解牛源犬新孢子虫MAG1基因的免疫学特性,根据MAG1基因序列,设计并合成了1对用于扩增MAG1基因的引物。将PCR扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE结果显示,MAG1在大肠杆菌中获得了较高水平的表达,表达蛋白的分子质量为65ku。Western-blot结果显示,表达的MAG1蛋白可被牛源犬新孢子虫阳性血清特异性识别,表明该MAG1蛋白具有较好的反应原性。本研究为新孢子虫病疫苗及诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

青海省格尔木市乳牛新孢子虫病的血清学调查

用重组蛋白GST-NcSAG1t作为ELISA诊断抗原,对格尔木市乳牛犬新孢子虫病进行了调查。结果,从35份乳牛血清样品中检出犬新孢子虫抗体阳性血清4份,阳性率为11.42%。检测结果说明,青海省格尔木市饲养的乳牛牛群中存在犬新孢子虫感染。     

我国犬钩虫ITS及5.8S rDNA的克隆与序列分析

以从我国广东湛江犬小肠中采集的2条犬钩虫作为研究对象,用保守引物NC5及NC2扩增犬钩虫rDNA的ITS-1、5.8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR和酶切鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果显示,来自湛江的2条犬钩虫ITS及5.8S rDNA序列总长均为738 bp,其中ITS-1序列长为364 bp,5.8S序列长为153 bp,ITS-2序列长为221 bp;2个不同样品之间ITS序列存在多态性,ITS-1序列存在5个碱基的差异,ITS-2序列存在1个碱基的差异,5.8S rDNA序列无差异。研究结果为犬钩虫进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。     

禽流感重组禽痘病毒疫苗不同途径及剂量接种的免疫效力

将表达禽流感病毒 (AIV)H5HA和N1NA基因的重组禽痘病毒 (rFPV HA NA)以不同剂量分别经翅下刺种、肌肉注射、皮下注射、点眼及滴鼻途径接种于 4周龄SPF鸡。结果 ,该疫苗经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种的SPF鸡 ,能够诱导其产生血凝抑制 (HI)抗体 ;用10 0LD50 的HPAIVA/Goose/Guangdong/ 1/ 96 (H5N1)毒株攻击后 ,免疫鸡无一发病和死亡 ,免疫保护率为 10 0 %。以点眼和滴鼻途径免疫的SPF鸡 ,大剂量接种能够诱导产生一定水平的抗体 ,攻毒后的保护率分别为 83.3%、6 6 .7% ;而小剂量接种则不产生免疫反应 ,保护率为 0。表明rFPV HA NA疫苗只有经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种 ,才能够诱导机体产生高水平的免疫力。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-T-HA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的 HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株的分离鉴定

为获得1株猪伪狂犬病病毒贵州分离株,将贵阳市某猪场送检的流产胎儿病料经一系列处理后接种Vero细胞,并对分离毒株分别进行了病毒理化特性、电镜形态观察、中和试验、动物接种试验、核酸检测等鉴定。当盲传至第3代时,出现细胞变圆变亮、脱落、呈拉网状特征的细胞病变;分离毒不耐酸和热,对5-碘脱氧尿核苷和有机溶剂氯仿敏感,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;透射电镜下可见位于囊泡中呈近圆形、有囊膜、150～180 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;将分离毒株接种家兔,能引起家兔奇痒、麻痹死亡;PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株。     

重庆市山羊博尔纳病病毒P24基因的检测

为了解重庆市山羊博尔纳病隐性带毒情况,分析博尔纳病病毒(BDV)的种系来源。采用巢式逆转录酶PCR结合荧光定量PCR(FQ-nRT-PCR)技术对重庆市60只山羊外周血单核细胞 (PBMCs)及脑组织中的BDV P24基因片段进行了检测,将阳性产物测序,并与国外BDV毒株进行了比较。结果,山羊外周血检测阳性率为8．3％(5／60),脑组织检测阳性率为10％(6／60)。该 BDV P24片段核苷酸序列与马源BDV H1766株同源性最高,达96．51％,与标准株Strain V和 He／80同源性为95．35％,并且编码的氨基酸序列也相同。表明,重庆市山羊中存在动物源性博尔纳病隐性带毒。该BDV P24核苷酸序列与Strain V和He／80株具有高度同源性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白糖基化位点缺失突变株的构建

以含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株全长感染性cDNA克隆的质粒pVR2332为模板,通过融合PCR方法扩增GP5蛋白第34、51位天冬酰胺糖基化位点缺失的突变序列,替换pVR2332质粒中编码GP5蛋白的DNA片段,分别获得重组质粒pVR-N34A、pVR-N51A。在体外转录后转染BHK-21细胞,转染后第48小时收集细胞接种Marc-145细胞,进行突变病毒的拯救。然后通过RT-PCR扩增拯救病毒GP5蛋白的编码序列,序列分析显示构建正确。间接免疫荧光试验证明拯救病毒能够正常表达GP5蛋白。同时,中和试验结果初步表明GP5糖基化位点缺失影响PRRSV与中和抗体的反应。猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白不同糖基化位点缺失突变株的获得将为进一步揭示GP5蛋白糖基化与诱发机体免疫反应之间的关系奠定基础。