非洲猪瘟病毒荧光RPA快速检测方法的建立及初步应用

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组中序列保守稳定的B646L基因设计特异性引物和探针,建立了敏感、特异、高效的ASFV核酸RPA快速检测法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测ASFV核酸,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等灭活病毒核酸无交叉反应;敏感性高,本试验中最低可检测到2×101copies/uL;检测时间短,15 min即可完成反应;重复性好。采用ASFV灭活抗原和猪血液制备模拟临床猪血样品,能检出灭活抗原的稀释度为1∶12 800,应用该方法对200份进口冻猪产品及供港猪场420份猪抗凝血进行检测,结果均为阴性,与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果相同。本研究建立的RPA快速检测法操作简便,尤其适合ASFV现场快速检测。     

非洲猪瘟病毒实时荧光RAA检测方法的建立

为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)简捷、高效的基层临床检测方法,本研究选取非洲猪瘟病毒保守基因B646L (P72)序列,设计特异性引物和探针,建立非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。结果显示,所建立方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法灵敏度相当,低至10 copies,μL,检测时长仅需10 min,与口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应。对100份临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR结果一致,但相较于荧光定量PCR检测时间的2h,检测时间大大缩短。结果表明,本研究建立的方法灵敏度较高、特异性较好,为ASFV早期临床诊断提供了技术支持。     

非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)实时荧光PCR检测方法,本研究根据ASFV CD2v基因序列,设计了TaqMan荧光PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针的比例,建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明,本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性,以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.988,斜率为-3.025 4,最低检测限可达到10 copies/μL,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于2%。综上,本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。     

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×10¹ copies/μL、1.19×10² copies/μL和5.99×103copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高10³倍,可应用于ASFV和PR...     

非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒（ASFV）实时荧光PCR检测方法，本研究根据ASFV CD2v基因序列，设计了TaqMan荧光PCR引物及探针，通过优化退火温度、引物及探针的比例，建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明，本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性，以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系，相关系数为0.988，斜率为 －3.025 4，最低检测限可达到10 copies/μL，且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好，批内和批间变异系数均小于2%。综上，本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。     

基于非洲猪瘟病毒p72蛋白的阻断ELISA检测方法的建立及初步应用

本研究以真核表达的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白为包被抗原,以抗ASFV p72蛋白的特异性单克隆抗体为检测抗体,经条件优化,建立了特异性检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。结果显示,最佳抗原包被量为100 ng/孔,待检血清样本最佳稀释度为1∶2,酶标抗体最佳稀释度为1∶10 000。该阻断ELISA方法的结果判定标准:当血清样品的PI≥41.84%时,判定为阳性;当血清样品的PI41.84%时,判定为阴性。特异性试验结果显示,该方法仅能与非洲猪瘟病毒阳性血清反应,与PRV、PCV2、PRRSV、CSFV和PPV等猪病疫苗毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒的对比检测结果表明,两种方法的符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法可以应用于ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及疫情监测提供了有效的检测手段。     

水泡性口炎病毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)的快速鉴别检测方法,本研究根据水泡性口炎病毒2种血清型相对保守的L基因为靶序列,分别设计2对型特异性引物和2条不同荧光基团修饰的探针。经过对反应体系的优化,建立了能够同时检测VSV-IND和VSV-NJ的双重荧光RTPCR方法。该方法能准确鉴别VSV两种血清型,与口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无非特异性扩增,特异性强。与普通RT-PCR相比,反应快速、灵敏度高。Ct值的变异系数小于3%,重复性好。利用所建立方法对126份临床样品进行检测,结果与普通RT-PCR相同。上述结果表明,本研究建立的方法为VSV-IND和VSV-NJ的同时鉴别检测提供了一种快速、特异和敏感的方法。     

非洲猪瘟病毒LFD-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)B646L基因保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速检测法。结果表明,该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等病原核酸无交叉反应;最低可以检测到1.57×10~2copies/μL重组质粒pUC-B646L;检测时间短,其中RPA扩增20 min,LFD检测10～20 min。应用该法及OIE推荐的荧光PCR法对24个模拟样品进行检测,检测结果一致。对50份已知的临床样品核酸进行检测,阳性符合率为73.3%。上述结果表明,本研究建立的LFD-RPA快速检测方法操作简便,为ASFV现场快速检测提供了技术支持。     

塞内卡谷病毒荧光RT-RPA快速检测方法的建立

本研究利用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术建立快速检测塞内卡谷病毒(SVV)的实时荧光RT-RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,能准确检测SVV核酸,与水泡性口炎病毒(VSV-IND和VSV-NJ)、猪水泡病病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测SVV核酸浓度为1.35×10~(-3)g/mL;简便快速,反应时间小于20 min;重复性好。利用所建立方法对116份临床样品进行检测,结果与实时荧光RT-PCR一致。本研究为SVV防控提供了一种快速检测的新方法,可用于基层实验室对SVV的快速检测。     

非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速诊断方法,本研究根据ASFV SY18株p17蛋白的编码基因D117L的保守序列设计并合成引物和探针,建立了基于ASFV p17蛋白的编码基因D117L的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1×10^9~1×10^1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.192,检测下限为10 copies/μL,且与其他能引起相似症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.920 7%,重复性好。此方法可用于ASF的早期诊断和ASFV快速检测。     

非洲猪瘟病毒NanoPCR检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏、适用于大批量样品检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的方法,本研究使用金纳米颗粒与传统PCR技术相结合,针对ASFV中P72保守序列,建立了一种新的ASFV的NanoPCR分子检测方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果表明,对于相关病毒,包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV),NanoPCR分析均未发现交叉反应。与常规PCR相比,NanoPCR灵敏度更高,每个反应的检出限为2.86×10~3copies/μL,而常规PCR检出限为2.86×10~4copies/μL。用建立的方法对23份临床样品进行检测,结果 ASFV的阳性检出率为60.86%。综上所述,本研究开发的灵敏、特异性的NanoPCR方法可广泛应用于ASFV感染的临床诊断和现场监测。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增诊断方法的建立

通过对GenBank中登录的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白基因序列进行分析,根据p72保守区序列设计合成了内(FIP,BIP)、外(F3,B3)2对引物,其中外引物扩增片段的大小为184bp。通过对反应条件进行优化,建立了非洲猪瘟LAMP检测方法。结果显示,该方法在62℃保温60min即可完成,最低可检测到1×101 copies/μL的病毒DNA,与常规PCR方法相比灵敏度高100倍。对ASFV、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒基因组DNA同时检测,结果仅有ASFV出现条带,而其他均未出现目的条带。表明,建立的ASFV-LAMP诊断方法具有较好的特异性和敏感性。     

非洲猪瘟病毒荧光量子点检测试纸条的研制

根据非洲猪瘟病毒（ASFV）VP72蛋白的氨基酸序列筛选合成多肽,并与载体蛋白BSA进行偶联,将以此得到的多肽作为抗原免疫小鼠,用来制备鼠源抗ASFV VP72蛋白的单克隆抗体。将上述方法制备的针对ASFV VP72蛋白的单抗作为荧光量子点标记的抗体,以与这种标记单抗互相配对的另一单抗包被检测线（T线）,采用山羊抗鼠二抗Ig G包被质控线（C线）,建立了一种简便、快速、准确的用于ASFV抗原检测的荧光量子点免疫层析试纸条。结果表明,制备的试纸条对于猪瘟等8种猪常见疫病免疫用灭活疫苗检测时无交叉反应;可检测到8μg/m L的VP72重组蛋白;与商品化的ASFV荧光定量PCR检测试剂盒进行比对检测,其对临床样品检测的阳性符合率为82.1%(23/28),阴性符合率为93.8%(75/80)。该试纸条特异性好、灵敏度高以及稳定性好,为ASFV的现场快速初步诊断提供了一种技术支持。     

基于金纳米颗粒标记非洲猪瘟病毒p30蛋白免疫层析检测方法的建立

为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),制备ASFV p30金纳米颗粒免疫层析抗体检测试纸条,并对该方法开展了初步评价。结果表明,该试纸条可在5-10 min完成检测;以健康猪血清、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等阳性血清作为对照,该方法仅特异性的检出ASFV感染的血清阳性样品,与各对照组血清无交叉反应;以进口ASFV抗体ELISA检测试剂盒作为金标准对阴、阳性样品进行对比检验,该试纸条检出的敏感性和特异性分别为92.52%和92.00%,说明本研究制备的ASFV p30抗体金纳米颗粒检测试纸条具有较高的敏感性和特异性,具备操作简便、检测快速和结果判断容易等特点,具有ASF现场检测的实际应用价值。     

猪δ冠状病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

为了快速准确地检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),本研究根据PDCoV基因序列保守区设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了一种特异性检测PDCoV的TaqMan-MGB荧光定量方法。结果显示,该方法特异性良好,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型等的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在3.15×108～3.15×101copies/?L范围内具有良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为10 copies/?L的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.25%～1.06%和0.58%～1.27%;对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量检测方法对PDCoV的阳性检出率(40%)高于常规PCR方法对PDCoV的阳性检出率(31.7%)。该方法的建立为PDCoV的实验室鉴别诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

猪圆环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

为了建立一种定量检测猪圆环病毒1型(PCV1)的实时荧光定量PCR方法,根据PCV1基因序列设计了1对特异性引物,并构建含有PCV1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测PCV1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法的标准曲线的决定系数为0.999,显示出优良的线性关系;最低可准确检测320copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%;该方法对PCV2、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等的检测结果均为阴性;对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于PCV1的检测与定量分析。     

同时检测五种引起猪繁殖障碍的病毒的多重PCR的建立

为建立一种能同时检测5种引起猪繁殖障碍的病毒的多重PCR方法,分别针对各病毒的保守序列设计了4对特异性引物,其中3对分别用于扩增猪瘟病毒(CSFV)E2基因、非洲猪瘟病毒(ASFV)VP72基因、伪狂犬病病毒(PRV)gB基因的目的片段;针对NSP2基因设计的1对引物用于区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)。通过对反应条件的优化,建立了快速检测CSFV、ASFV、PRV、PRRSV和HP-PRRSV的多重PCR方法。敏感性试验结果显示,该多重PCR对这5种病原核酸的最低检测量分别为2.10×103(HP-PRRSV),1.30×103(PRRSV),1.09×104(CSFV),1.50×103(ASFV)和8.97×102(PRV)copies/μL。对49份临床样品的检测结果显示,它们的混合感染率为51%(25/49)。该方法对阴性样本的扩增结果均为阴性,并且无交叉反应性,表明该方法特异性良好,具有快速、灵敏且成本低等优点,能够对猪繁殖障碍病毒病的单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断,并对其流行病学调查具有深远意义。     

伪狂犬病病毒野毒株新型可视化环介导等温扩增检测方法的建立

利用环介导等温扩增(LAMP)与pH指示剂结合的方式建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的快速检测方法,并优化反应体系。结果显示,该方法特异性良好、敏感性较高,检测限达100.5TCID50,与荧光定量PCR的敏感性一致。对52份临床样品进行检测,用荧光定量PCR检测出30份阳性样品,LAMP检测出27份阳性样品,二者的符合率为94.2%。结果表明,PRV野毒株新型可视化LAMP检测方法操作简便、结果判别明显、检测成本低,可预期应用于PRV带毒猪的快速筛查,这对于猪伪狂犬病的净化具有重要意义。     

猪细环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

参考猪细环病毒1型(TTSuV 1)基因非编码区保守序列设计了1对特异性引物,构建含有TTSuV 1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测TTSuV 1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法标准曲线的决定系数为0.999 5,表明具有优良的线性关系;最低可精确检测63copies/μL的核酸模板;重复性试验的变异系数小于2%;对TTSuV 2、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等均检测不到荧光信号。对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于TTSuV 1的检测与定量分析。     

猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪嵴病毒3D基因保守序列设计引物和Taq Man探计,通过优化反应体系,建立了猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性评价;同时以10倍梯度稀释的质粒标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线,构建定量分析模型。结果显示,建立的方法能特异性检测猪嵴病毒,与其他引起猪腹泻的病毒无交叉反应,对标准品的检测灵敏度达10 copies/L;标准曲线Ct值和模板终浓度在107~10 copies/L范围内有良好的线性关系;重复性试验变异系数均小于2.5%。对139份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR阳性检出率为30.94%(43/139),常规RT-PCR为29.50%(41/139)。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪嵴病毒的快速检测和流行病学调查。