基于乙肝核心抗原和猪流行性腹泻病毒S蛋白B细胞复合表位基因重组疫苗的免疫原性研究

为了研制新型、有效的猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗,本研究以乙肝核心抗原蛋白(HBcAg)作为多表位免疫原的载体蛋白,将PEDV S蛋白中的3个B细胞表位基因与S1截短序列基因串联后,插入到编码HBcAg的免疫显性区的基因中,构建重组质粒HBcAg-PE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组蛋白HBPE经过纯化和Western-blot鉴定后,以不同剂量的重组蛋白通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,对其免疫效果进行了初步评价。结果显示,重组蛋白HBPE在BL21(DE3)中以沉淀形式表达,纯化、复性后的重组蛋白HBPE能够与PEDV阳性血清发生特异性反应。重组蛋白HBPE能够刺激小鼠产生抗PEDV特异性抗体,同时可以产生相关的Th1型和Th2型细胞因子。上述结果表明,本研究成功构建了PEDV重组B细胞复合表位抗原HBPE,并在小鼠模型中初步评价了其免疫原性,为今后新型PEDV基因工程疫苗的研制提供了新的思路。     

A型口蹄疫病毒衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及免疫效果分析

为了探索更有效的A型口蹄疫(FMD)表位疫苗,根据已鉴定的A型口蹄疫病毒(FMDV)主要抗原位点,结合基因序列比对分析,选择了A型FMDV流行毒株的主要抗原位点区进行表位蛋白分子的设计表达。所用表位序列包括A/QH/CHA/2013的VP2 70～81位、118～140位,VP1 G-H环131～157位、C末端188～212位,A/WH/CHA/09 VP1 43～48位、VP3 55～72位,以及非结构蛋白3A中的T细胞表位和通用性T细胞表位,构建免疫原蛋白分子命名为ANX2和ANX3,其中ANX2采用了表位序列反向串联的方式进行设计,用大肠杆菌表达免疫原基因,纯化表位蛋白免疫小鼠和猪,分析特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,并对免疫猪进行了攻毒保护试验,评价表位疫苗的保护效果。结果显示,ANX2、ANX3重组蛋白以包涵体表达为主,蛋白大小约为41 ku和39 ku,均能与A型FMDV阳性血清发生特异性反应;免疫小鼠和猪后都能产生抗A型FMDV特异性抗体;用表位蛋白刺激免疫小鼠脾淋巴细胞,细胞因子IFN-γ和IL-4均有明显的升高;攻毒后对猪有一定的保护作用,ANX2的免疫效果略优于ANX3,证明表位序列反向串联更有利于抗原表位的展示,从而增强其免疫效果。本研究为A型FMDV表位疫苗的研究积累了经验。     

重组牛IFN-α对亚洲Ⅰ型口蹄疫亚单位疫苗免疫小鼠的影响

在大肠杆菌BL21(DE3)中分别表达了牛IFN-α基因、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)VP1和VP1 C末端基因,并纯化了所表达的蛋白。用透析的方法进行蛋白复性后制成油乳剂疫苗,经皮下多点注射免疫小鼠,以MTT法检测小鼠脾淋巴细胞经植物血凝素(PHA)刺激后的增殖反应活性;以液相阻断ELISA检测血清FMDV特异抗体的变化。结果表明,重组VP1(rVP1)和rVP1 C末端蛋白能单独诱发小鼠的体液免疫反应和微量的细胞免疫反应,而与重组牛IFN-α(rBoIFN-α)共同接种的小鼠,体液免疫反应和细胞免疫反应更为明显。     

猪圆环病毒2型两种重组多表位蛋白免疫效果的评价

Cap蛋白和Rep蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2)的2个主要蛋白,其中含有很多表位。本研究合成了由3个Cap蛋白表位和1个Rep蛋白表位组成的2个表位串联体,利用NcoⅠ、SpeⅠ和SalⅠ位点,将Hsp65基因与表位串联体依次克隆到pET30a,把构建的重组表达质粒PHE转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,诱导重组蛋白的表达。将表达的两种重组蛋白HSP-e-1和HSP-e-2纯化复性后分别免疫小鼠,结果被免疫的小鼠产生特异性抗体,其中HSP-e-2产生的抗体水平较高,而HSP-e-1的淋巴细胞增殖结果要优于HSP-e-2。结果表明,牛型分枝杆菌Hsp65能够作为多表位肽的载体,而融合蛋白HSP-e-1和HSP-e-2可作为PCV2新型疫苗的候选物。     

金黄色葡萄球菌疫苗候选分子StbA主要抗原表位区的表达及重组蛋白抗血清的制备

通过生物信息学软件分析金黄色葡萄球菌转铁蛋白结合蛋白(StbA)的主要抗原表位区,PCR扩增StbA主要抗原表位区的编码序列;将该序列插入表达载体pGEX-4T-1中,测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌能表达出分子质量约为54 000u的重组融合蛋白。表达产物经亲和层析纯化后可获得较高纯度的目的蛋白。Western-blot检测证实该重组蛋白能与乳腺炎患病奶牛恢复期血清发生阳性反应。ELISA结果显示,重组蛋白免疫新西兰大白兔能产生高效价的抗血清,提示StbA主要抗原表位区能刺激机体产生强大的免疫应答,StbA是一个有潜力的保护性抗原候选分子。     

牛A型多杀性巴氏杆菌三聚体自转运蛋白免疫保护性的研究

为研究多杀性巴氏杆菌三聚体自转运蛋白(TAAs)的免疫保护效果,在对牛A型多杀性巴氏杆菌Pm CQ2株假定TAAs编码基因Pm1g0001的黏附基序分析基础上,对其黏附基序进行PCR扩增,并与质粒p ET-32a(+)连接,将重组质粒转入BL21(DE3)诱导表达获得重组蛋白,纯化后与佐剂混合免疫小鼠,三免后收集小鼠血清检测抗体效价,并用Pm CQ2菌液进行攻毒保护性试验。结果显示,Pm1g0001的黏附基序具有TAAs的典型结构,重组蛋白r Pm1g0001免疫小鼠后可以刺激机体产生高效价抗体,对Pm CQ2的保护率达60%,具有良好的免疫保护效果,提示牛A型多杀性巴氏杆菌三聚体自转运蛋白可以作为研究新型亚单位疫苗的候选靶标。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的原核表达及其产物的活性检测

利用分别带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增出FMDV 3ABC基因,将其克隆到pMD18-T载体。经BamHⅠ和SalⅠ酶消化后,克隆到表达载体pGEX-6p-1上,构建重组质粒pGEX-3ABC。将该重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS,经终浓度1 mmol/L的IPTG诱导,获得约70 ku的融合蛋白GST-3ABC。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白GST-3ABC可以与感染FMDV的牛血清发生免疫反应。以纯化的GST-3ABC蛋白为抗原的间接ELISA检测结果与以VP2蛋白为抗原的间接ELISA检测结果相比较,表明,融合蛋白GST-3ABC可以用于鉴别感染FMDV和疫苗免疫的牛血清。     

利用RNA复制子融合表达口蹄疫病毒抗原表位与分子内佐剂的研究及其表达产物的免疫学分析

为了探究新型疫苗载体在口蹄疫防控中的应用,本研究构建了一种融合表达口蹄疫病毒抗原表位与分子内佐剂的RNA复制子。首先将FMDV毒株O/BY/2010 B、T表位及霍乱毒素B和α-干扰素基因构建到RNA复制子载体中,通过将复制子质粒线性化并进行体外转录,得到复制子RNA。将该RNA转染BHK-21细胞,用Western-blot以及RT-PCR验证其正确表达后,选择不同佐剂免疫小鼠,用ELISA检测特异性抗体的产生。结果,重组复制子能够在BHK-21细胞内正常表达,免疫小鼠后能够诱导产生特异性抗体。综上所述,本研究构建的重组RNA复制子能够表达FMDV抗原表位与分子内佐剂,为口蹄疫RNA疫苗的研制提供了理论基础。     

牛源多杀性巴氏杆菌融合基因pm0979-PlpE的表达及其融合蛋白的免疫效果

为研究多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)pm0979-PlpE融合蛋白的免疫效果,本研究分析获得了主要抗原表位基因pm0979、PlpE,并将2个抗原表位通过疏水性linker进行拼接融合,构建了原核表达载体pET-30a-pm0979、pET-30a-PlpE及pET-30a-pm0979-PlpE,并将构建成功的载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行表达从而获得融合蛋白。纯化重组蛋白并用其免疫小鼠,二免后,测定抗体产生情况,并进行牛源Pm CQ2株及Pm B型攻毒试验,测定各自对小鼠的交叉保护效果。结果显示,3种重组蛋白都能诱导机体产生较高水平的抗体并具有交叉保护作用,但抗原表位融合的重组蛋白pm0979-PlpE的交叉保护效果最好,分别达80%(Pm CQ2株)和40%(Pm B型)。上述研究结果初步提示了该融合蛋白作为预防多杀性巴氏杆菌疾病的可行性,为研制新型广谱的多杀性巴氏杆菌疫苗奠定了基础。     

抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs免疫豚鼠的免疫增强作用

为了探索壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的免疫增强作用,本研究利用O型口蹄疫病毒(FMDV)的病毒样颗粒作为抗原,通过Chitosan A或者加入白油后制成的混合乳Chitosan B两种壳聚糖凝胶微球与VLPs配伍免疫豚鼠,免疫后测定被免疫豚鼠的T淋巴细胞增殖情况,检测FMDV特异性抗体水平,观察计算攻毒后保护率。结果,壳聚糖季铵盐凝乳胶微球能够诱导豚鼠产生高水平的FMDV特异性抗体,T淋巴细胞增殖效果高于ISA201佐剂。此外,Chitosan B佐剂组优于Chitosan A佐剂组。上述结果说明,壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型FMD VLPs具有免疫增强作用,可以诱导VLPs的体液免疫和细胞免疫应答;壳聚糖季铵盐凝乳胶微球是一种具有潜力的疫苗佐剂,可以成为FMDV疫苗的候选佐剂。     

猪多杀性巴氏杆菌PlpP基因的原核表达及其免疫保护性的研究

为研究猪多杀性巴氏杆菌PlpP基因的免疫保护性,根据GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌全基因组中的PlpP基因序列,对目的基因进行PCR扩增,并将PCR片段克隆至载体pET-28a(+)中,再将重组表达质粒pETPlpP转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。序列分析表明,得到了1条大小为945bp的基因片段,与预期大小相符。SDS-PAGE检测结果证实,该基因可以在BL21(DE3)中表达,表达产物为分子质量约45ku的融合蛋白。将纯化的重组蛋白pETPlpP制备成亚单位疫苗,并经皮下途径免疫小鼠,二免后第2周均以5LD50的A、B和D这3种荚膜抗原血清型的多杀性巴氏杆菌分别对小鼠进行攻毒,结果显示,A、B和D这3种血清型的保护率分别是16.67%、33.33%和66.67%。上述结果说明PlpP蛋白具有一定的免疫保护性。     

大熊猫白细胞介素-18的原核表达及免疫功能分析

以本实验室构建的含有GpIL-18编码区序列的质粒pMD-GpIL-18为模板,PCR扩增GpIL-18ORF后连接到pET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,纯化目的蛋白(PGpIL-18)。利用荧光定量PCR检测PGpIL-18蛋白对C57BL/6J小鼠脾细胞中细胞因子的影响。将PGpIL-18蛋白与细菌疫苗同时注射小鼠,检测其免疫增强效应。Western-blot结果表明,IPTG诱导PGpIL-18融合表达;其产物PGpIL-18能刺激小鼠脾细胞大量分泌IFN-γ,增加GM-CSF和TNF-α的表达量。同时注射PGpIL-18蛋白和细菌疫苗的小鼠血清中IgG的质量浓度明显高于对照组。同时,通过金黄色葡萄球菌和大肠杆菌攻毒试验,发现PGpIL-18蛋白可以提高疫苗对小鼠的保护率。PGpIL-18能促进特异性免疫应答的发生,这一结果为重组PGpIL-18蛋白作为佐剂的开发利用奠定了理论基础。     

结核分枝杆菌rv1738基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌rv1738基因,并制备针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,以结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA为模板,PCR扩增rv1738基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-rv1738。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍柱亲和纯化重组蛋白,用SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况,并用Western-bolt分析表达蛋白的反应原性。最后,以纯化的Rv1738蛋白免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a(+)-rv1738,经IPTG诱导在重组大肠杆菌中表达出分子质量为20ku的目的蛋白,并且以可溶的形式表达;对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白Rv1738能与家兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。纯化的Rv1738蛋白免疫小鼠后,能有效地刺激特异性抗体的产生,血清ELISA效价达到1∶8 800,且具有良好的特异性。以上结果表明,成功克隆表达了结核分枝杆菌rv1738基因,并制备了针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,这一结果为探索Rv1738蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制方面的潜能奠定了基础。     

日本血吸虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆表达及表达产物的免疫保护效果的评估

为掌握日本血吸虫钙调神经磷酸酶B亚基(CNB)特性并评估其作为候选疫苗分子的潜力,采用PCR方法扩增日本血吸虫CNB基因,构建重组质粒pET-28a(+)-CNB,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用His-Bind亲和层析纯化获得重组蛋白rCNB。Western-blot结果显示,rCNB能被该重组蛋白免疫小鼠血清识别,具有较好的免疫原性。免疫组织化学分析表明,CNB主要分布在日本血吸虫虫体的睾丸、卵巢等生殖器官中,在表膜中也有少量分布。用重组蛋白rCNB结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,结果 rCNB诱导小鼠产生了27.93%(P0.05)的减虫率和42.93%(P0.01)的肝减卵率。结果表明,日本血吸虫CNB具有一定的免疫保护效果,为深入研究日本血吸虫钙调神经磷酸酶的生物学功能奠定了基础。     

马流产沙门菌鞭毛重组蛋白FliC的原核表达及对小鼠的免疫保护试验

为研究马流产沙门菌新疆分离株鞭毛蛋白FliC(flagellin C)的免疫生物学特性及保护特性。本研究利用PCR技术扩增获得该菌的Fli C基因,并将其连接到原核表达载体p ET-28a(+)上,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western-blot检测与分析表达蛋白,并将纯化的重组蛋白免疫小鼠。结果显示,成功诱导表达了52 ku的重组蛋白,该蛋白第2次免疫小鼠第14天时血清中的特异性Ig G抗体效价可达1∶72 900,且抗体亚型以Ig G1为主,免疫小鼠的攻击保护率可达73%。结果表明,Fli C重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果。为进一步开展马流产沙门菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

A型口蹄疫病毒多抗原表位杆状病毒表达载体的构建及表达

为构建A型口蹄疫病毒(FMDV)多抗原表位杆状病毒表达载体,将A型FMDV上5个B细胞表位(VP1140-160aa、VP270-80aa、VP352-67aa、3B29-42aa和3D16-30aa)和4个辅助性T细胞表位(VP1200-213aa、VP420-34aa、3A21-35aa和3D346-370aa)通过人工合成的方法串联起来构建复合多表位基因B。然后将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB。将酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒pFastBac HTB-B转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将PCR鉴定正确的重组杆状病毒质粒利用CellfectinⅡReagent转染至Sf9细胞。通过间接免疫荧光试验和Western-blot检测表达情况。结果显示,能够得到与A型FMDV猪抗阳性血清结合的蛋白,大小约为22.3ku,与预期结果相符。结果表明,成功构建了A型FMDV多抗原表位杆状病毒表达载体,并在昆虫细胞中正确表达,为下一步蛋白纯化奠定了基础。     

猪细小病毒AV30 VP2基因在昆虫细胞中表达及其免疫原性鉴定

本研究选用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统构建含有猪细小病毒AV30未优化、优化后衣壳蛋白VP2基因的重组杆状病毒,感染sf9、HF细胞表达VP2蛋白。首先,扩增PPV AV30得到VP2基因,测序后由公司根据昆虫细胞嗜性进行基因优化。同时构建并收获未优化、优化重组杆状病毒r BacVP2。其感染HF细胞后,进行Western-blot及IFA实验分析表明,未优化、优化VP2蛋白在昆虫细胞中正确表达,分子质量约为64 ku,并具有良好的反应原性。电镜观察,未优化、优化VP2蛋白均自我组装成VLP,与PPV AV30病毒粒子大小形状相似。最后,用VP2-VLP免疫BALB/c小鼠,能刺激小鼠产生抗PPV的特异性抗体。免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞在PPV AV30病毒的刺激后,出现显著的增殖情况,同时产生了Th1和Th2型相关细胞因子。本研究成功构建了VP2-VLP,并在小鼠实验中显示了良好的免疫效果,为以VP2为表位载体的嵌合型病毒样颗粒疫苗进一步研制奠定了基础。     

停乳链球菌GapC的免疫特性分析及B细胞抗原表位的筛选与鉴定

旨在表达牛乳源停乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GapC）,预测并鉴定其B细胞抗原表位。本研究采用PCR扩增停乳链球菌GapC基因,构建重组质粒p ET-28a-TR-X16087-2。经IPTG诱导表达后纯化GapC蛋白,并以纯化的GapC蛋白免疫小鼠,采用ELISA方法检测Ig G抗体效价及抗体分型,分析对小鼠的免疫保护效力。结果显示,成功表达了大小为44 ku的GapC蛋白,对小鼠的免疫保护率为76%。预测并筛选出3个B细胞抗原表位,鉴定了1个优势抗原表位BP3:196PHRGGDLRRARAGAAN206。上述结果表明,本研究成功表达了停乳链球菌GapC蛋白,对其免疫效果进行了评估,预测与鉴定了其B细胞表位,为GapC蛋白功能和表位疫苗的研究奠定了基础。     

可介导多药耐药的cfr基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为建立监测Cfr蛋白的方法奠定基础,采用PCR方法扩增cfr基因,并克隆入pEasy-T载体;测序确认后克隆入pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-cfr,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并用IPTG诱导表达Cfr蛋白;用纯化的Cfr蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对抗体进行鉴定。结果显示,成功克隆了全长cfr基因,构建了重组质粒pET-28a-cfr,并诱导了Cfr蛋白表达以及制备了小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体;Western-blot法鉴定该抗体可特异性识别重组蛋白Cfr;ELISA法测定抗体效价为1∶64 000。结果表明,用大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达Cfr蛋白,并且获得了高特异性、高效价的小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体。