单增李斯特菌四环素耐药基因tetM膜接合转移的研究

为探讨猪链球菌能否成为单增李斯特菌四环素耐药基因tetM的水平传播宿主,以携带该基因的单增李斯特菌四环素耐药菌株为供体菌株,猪链球菌的红霉素耐药菌株为受体菌株进行滤膜接合试验。同时对供体菌株进行了转移相关基因int-Tn的PCR检测。结果显示,获得19个接合子,接合转移率为4×10-7。接合子均对四环素耐药,且接合子中均PCR扩增到tetM基因,该基因克隆测序结果与供体菌中tetM基因序列完全一致。同时,从供体菌株中扩增到整合酶编码基因int-Tn。这说明猪链球菌可以成为单增李斯特菌四环素耐药基因tetM的水平传播宿主,并且该基因的水平转移与整合子有密切关系。     

广东地区副猪嗜血杆菌的耐药性调查及遗传相关性分析

对广东地区分离的副猪嗜血杆菌进行耐药性调查以及遗传相关性分析,以获得临床分离株的耐药性特征和耐药菌的传播扩散机制。采用微量肉汤稀释法测定了95株副猪嗜血杆菌对临床常用的18种抗菌药物的敏感性。用PC R方法检测6类抗生素耐药基因的携带情况,并运用脉冲场凝胶电泳(PFG E)对携带相关耐药基因的菌株进行遗传相关性分析。结果表明,所有测试菌株对头孢噻呋和头孢噻肟均表现出较好的敏感性;对左氧氟沙星、红霉素、氟苯尼考和青霉素敏感性下降,耐药率分别为3.2%、5.3%、7.4%和13.7%。同时也检测到较高的耐药水平,对甲氧苄啶+磺胺甲噁唑、恩诺沙星和头孢克洛的耐药率分别为83.2%、46.3%和36.8%;对四环素(23.2%)、氨苄西林(22.1%)、庆大霉素(21.1%)和环丙沙星(20.0%)表现为中等水平的耐药。在95株菌中,26株菌(27.4%)携带有耐药基因,共检出5种耐药基因,检出率依次为tet(B)(21.1%)、aph(3′)-Ⅰ(9.5%)、sul2(9.5%)、aad A 1(8.4%)和blaROB-1(6.3%),其中15株菌同时携带有2个以上的耐药基因。在这些耐药基因阳性菌中,PFGE分析结果显示出遗传背景的多样性,同时,也观察到小范围的克隆。     

基于高通量测序的一株鸭疫里氏杆菌的耐药表型和耐药基因分析

为研究鸭疫里氏杆菌耐药表型与耐药基因的关系,从浙江某鸭场病鸭体内分离到1株病原菌,经菌落形态和革兰染色特性观察、生化鉴定、PCR鉴定、动物回归试验,确定其为鸭疫里氏杆菌强毒株,血清凝集试验表明其为血清11型;药物敏感性分析结果显示,该菌对多黏菌素、复方新诺明、庆大霉素、四环素等耐药,对氨苄西林、头孢拉定、头孢唑林等敏感,属于多重耐药菌株;通过基因组高通量测序分析,检测到与表型相关的多黏菌素、红霉素、四环素等相关耐药基因,同时检测到多药外排泵及多药耐药蛋白基因,耐药表型与耐药基因检测结果相符。结果表明,通过高通量测序技术能准确获得鸭疫里氏杆菌分离株抗生素耐药的相关基因信息,对鸭疫里氏杆菌病的临床用药具有一定指导意义。     

鸡源致病性沙门氏菌新近分离株的耐药性与耐药基因

为了了解河南省鸡源沙门氏菌新近分离株的药物敏感性和耐药基因的存在情况,为进一步研究细菌耐药的分子机制和新型抗菌药物的研制提供资料,利用K-B法检测了98株鸡源沙门氏菌对22种药物的敏感性,采用PCR方法检测了13种常见耐药基因在分离株中的分布情况。结果显示,所有菌株对红霉素、青霉素、阿齐霉素和氨苄西林的耐药率均在60%～100%之间。三重以上耐药的菌株高达96.94%,七重以上耐药的菌株为56.12%,耐药最多的菌株可耐受18种抗生素。从13种常见耐药基因中扩增到3种四环素类、2种氨基糖苷类、2种β-内酰胺类、1种氯霉素类和3种磺胺类耐药基因。研究表明,沙门氏菌极易产生耐药性,耐药基因广泛存在于耐药菌株中,但耐药表型与耐药基因之间无绝对相关性。     

四川省2009-2014年鸡源沙门菌耐药性变迁的调查

为掌握四川省近几年鸡源沙门菌的耐药性变迁情况,本研究于2009-2014年间采集了四川省主要肉鸡养殖场的泄殖腔样品5 445份,分离鉴定获得沙门菌154株,总分离率为2.83%,占主导的血清型为肠炎沙门菌(71.9%)。采用微量肉汤稀释法测定分离菌株对13种抗菌药物的敏感性。药敏试验结果显示,沙门菌对氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸的耐药率最高,分别为83.8%和79.9%,对除多黏菌素E以外的其他10种药物的耐药率大于40%,对多黏菌素E相对敏感。分析了鸡源沙门菌对不同抗菌药物的耐药性随年份的变迁情况;结果显示,2009-2014年鸡源沙门菌对头孢噻呋、庆大霉素、四环素、多西环素、氟苯尼考、复方新诺明、恩诺沙星、氧氟沙星和多黏菌素E这9种药物的耐药率呈上升趋势。6年间多重耐药菌株的比例维持在较高水平(60%),且四重以下耐药菌株的比例逐年下降,而十一重以上耐药菌株的比例呈上升趋势,某些多重耐药谱在多个年份中都有检出。研究结果表明,四川省鸡源沙门菌的耐药情况十分严重,亟须加强养禽业抗菌药物的合理应用以控制耐药性的发展。     

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌耐药基因型和表型的相关性分析

为研究奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌耐药基因型和表型的分布,并对其相关性进行分析,采用PCR方法对从奶牛乳腺炎乳样中分离的33株金黄色葡萄球菌进行耐药基因检测,采用微量肉汤稀释法测定其对7种药物的敏感性。PCR结果显示,fos A、erm B、erm Cb、aph(3′)-IIIa和lin A/A′基因的检出率分别为51.52%、87.88%、100%、100%和6.06%;未检测到mec A、fos B、fos C、tet M、erm Ab、msr A、msr B、mef A、aac(6′)-Ie+aph(2″)、ant(4′)-Ia、van A、van B、van C1、van C2/3等14种耐药基因。药敏试验结果显示,金黄色葡萄球菌对磷霉素最为敏感,敏感率高达100%,磷霉素可作为临床备用药物;对红霉素的耐药现象最为严重,达到了93.94%;对氨苄西林和克林霉素的耐药率均达到72.73%。相关性分析表明,fos B、fos C基因型和磷霉素耐药表型一致;红霉素耐药占比为93.94%,与erm B基因(87.88%)、erm Cb基因(100%)比较接近。     

大肠埃希氏菌和沙门菌氨基糖苷耐药基因PCR检测方法的建立

采用平板稀释法,选用氨基糖苷类药物链霉素、庆大霉素、卡那霉素和新霉素对22 株猪、鸡大肠埃希氏菌和30株猪、鸡沙门菌进行了药敏试验。结果显示,在4种药物中大肠埃希氏菌对卡那霉素的耐药率最高,达81.8%,而沙门菌则对链霉素的耐药率最高,达60%,两类细菌都对新霉素的耐药率最低。设计了5对引物,对耐药基因aph(3′) Ⅱ、aadA1、aadA2、aadB和aac(3) Ⅰa进行了扩增,获得的基因片段与预期的大小一致;序列分析表明,扩增产物与GenBank中的相应序列有很高的同源性(>99.8%)。采用建立的PCR技术,对22株猪、鸡大肠埃希氏菌和30 株猪、鸡沙门菌的耐药基因进行了检测,证实耐药基因普遍存在,在大肠埃希氏菌中aadA1 基因的检出率最高(12/22),在沙门菌中aph(3′) Ⅱ基因的检出率最高(18/30),在所有的菌株中都未能检测出aac(3) Ⅰa基因。     

野生动物园不同源性大肠杆菌耐药性及PFGE分型研究

为了解福州动物园内不同源性大肠杆菌的耐药性及亲缘情况,为大肠杆菌病防治提供依据,笔者用微量肉汤法对8种抗菌药物进行药敏试验、PCR法检测intⅠ1、blaamp C、gyr A基因,并采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法对分离自不同源性的大肠杆菌进行DNA指纹图谱分型,比较菌株之间的亲缘关系。结果显示,不同源性大肠杆菌耐药率为84.30%,其中复方新诺明(66.94%)、四环素(65.29%)和头孢唑林(48.76%)耐药率最高;多重耐药以2~4重耐药为主,占67.86%;intⅠ1基因检出率为24.79%,gyr A基因检出率为83.47%,blaamp C基因检出率为85.95%;PFGE分型结果显示,各菌株之间相似系数大部分在40%~75%之间,少数在70%~75%。结果表明,福州动物园内大肠杆菌整体耐药情况较严重,intⅠ1、blaamp C、gyr A基因与多重耐药具有相关性;动物源性、环境源性和人员性之间存在的多重耐药大肠杆菌之间未发现同一菌株的垂直克隆传播,没有流行病学相关性。     

屎肠球菌携带毒力基因及其耐药性检测

为探究屎肠球菌携带毒力基因及耐药性相关基因,本研究采用PCR方法对不同来源的41株屎肠球菌中携带10种毒力基因、万古霉素耐药基因和四环素耐药基因进行检测,并应用K-B纸片法分析屎肠球菌对9种抗生素的敏感性。结果表明,在41株屎肠球菌中检测3种毒力基因gel E、efaAfs和ccf的阳性率均为100%,其他毒力基因的阳性率依次为cpd(80.49%)、agg(39.02%)、cylM(4.88%)、cylB(9.76%)、cylA(9.76%)、cob(4.88%)及esp(0);在41株屎肠球菌中,能检测出4种毒力基因的菌株数占46.34%,能检测到5种毒力基因的菌株数占29.27%;41株屎肠球菌对庆大霉素、萘啶酸和卡那霉素的耐药率均为100%,对其他抗生素的耐药率分别为诺氟沙星(31.7%)、四环素(26.83%)、氯霉素(7.31%)、万古霉素和阿莫西林(4.88%)、氨苄西林(0)。通过对不同基质屎肠球菌携带毒力基因和耐药性的检测分析,为今后屎肠球菌毒力基因和耐药性的分子机制研究奠定基础。     

广东省猪源葡萄球菌耐药性分析及多重耐药基因cfr的流行现状

为了解2013-2017年间广东省猪源葡萄球菌的耐药情况及多重耐药基因cfr的流行现状,采集生猪养殖场和交易市场猪鼻腔拭子分离葡萄球菌,采用琼脂稀释法测定分离菌株对14种抗菌药物的敏感性,并用PCR检测mecA和cfr基因的携带情况。结果显示,在采集的4099份样品中分离到葡萄球菌1485株,其中金黄色葡萄球菌173株。猪源葡萄球菌对红霉素、四环素、泰妙菌素、克林霉素、沃尼妙林和氟苯尼考耐药严重,耐药率分别为91.0%、90.2%、87.7%、84.6%、84.6%及82.0%,对利福平和利奈唑胺相对敏感,未发现万古霉素耐药菌株;庆大霉素、四环素、红霉素和环丙沙星的耐药率呈现逐年上升的趋势。在1485株葡萄球菌中,mecA和cfr的检出率分别为39.9%和12.3%。cfr阳性菌株常携带多种耐药基因,cfr基因的遗传背景也呈现多样化。结果表明,广东省猪源葡萄球菌的耐药情况严重,cfr的检出率高,应加强养殖业中抗菌药物的规范和合理使用,减缓耐药性的产生和传播。     

野生动物园不同源性VRE耐药性及REP-PCR分型研究

为了解福州市野生动物园内不同源性耐万古霉素肠球菌的耐药现状及亲缘情况,进而指导兽医临床合理用药,并对控制耐药性传播提供理论依据。用微量肉汤法对6种抗生素进行药敏试验,PCR法检测VanA、VanB、VanC1和VanC2/C3基因,并采用重复基因外回文序列PCR分析技术(REP-PCR),对分离自不同源性的耐万古霉素肠球菌进行基因多样性研究,比较菌株之间的亲缘关系。结果显示,福州市动物园内不同源性肠球菌分离到VRE共41株,耐药率高达100%,其中红霉素(100%)、土霉素(97.58%)和氯霉素(86.67%)耐药率最高;氨苄西林和万古霉素敏感率分别为92.12%和84.85%;万古霉素相关耐药基因VanA检出率为4.88%,VanB基因检出率为17.07%,VanC1基因检出率为31.71%,VanC2/C3基因检出率为39.02%;REP-PCR分型结果显示,不同来源的耐万古霉素肠球菌菌株大致可分为2~3个型,其中,分离自动物园环境的H2和H3、H1、H8和H9及分离自动物园不同动物的M9和NL6、MH5和MH8、M3、BM3和L6具有100%同源性。结果表明,动物园内肠球菌整体耐药情况较严重,耐药基因VanA、VanB、VanC1和VanC2/C3基因与多重耐药具有相关性;动物源性、环境源性和人员性VRE之间发现同源性100%的菌株,可能存在同一菌株的垂直克隆传播,不同源性VRE之间存在一定的流行病学相关性。     

安徽鸡源大肠杆菌整合子-基因盒分布及同源性分析

参照CLSI推荐的微量肉汤稀释法检测了15种抗菌药物对91株鸡源大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC),采用PCR方法检测其整合子-基因盒的分布情况,并用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析大肠杆菌的同源性。结果显示,91株大肠杆菌对15种抗菌药物的耐药率为3.3%~98.9%,且全部为四重耐药以上,多重耐药率为100%。91株大肠杆菌全部携带Ⅰ型整合子,其中70株带有编码耐氨基糖苷类和磺胺类药物的基因盒,分别是dfr A1+tnp A IS26+aad A1(45/70),dfr A12+aad A2(16/70)和dfr A1+aad A1(9/70),未检出Ⅱ型整合子。PFGE分型图谱显示,91株大肠杆菌共产生63个谱型,菌株之间的相似系数为30%~100%,31种谱型的同源性高达90%以上。其中41种带型只包含1株菌,其余22种带型包含菌株数为2~4株。结果表明,安徽合肥地区鸡源大肠杆菌对抗菌药物的耐药性较高,Ⅰ型整合子分布广泛,菌株基因分布呈多态性但同源性较高。     

猪场环境中大肠杆菌的耐药性检测及其耐药机理

为探讨猪场环境中大肠杆菌的耐药性及其耐药机理,随机选取从规模养猪场环境中分离的31株大肠杆菌,采用药敏纸片法检测其耐药性、PCR法检测其qnrA和aac(6’)-Ib基因存在状况,然后采用高温-SDS法对其中1株分离菌进行耐药质粒消除试验。结果显示,所分离的31株大肠杆菌对青霉素、四环素、洁霉素、红霉素、罗红霉素等抗生素呈现不同程度的耐药性;在所有试验菌株中未检出qnrA基因,而可检出aac(6’)-Ib基因的有8株;通过对含aac(6’)-Ib基因质粒的消除,分离菌株可获得对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素的敏感性。表明猪场环境中的大肠杆菌对临床常用药物产生了广泛的耐药性,而含aac(6’)-Ib基因质粒可介导环境中的大肠杆菌对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素耐药。     

重组蛋白P60与LLO对单核细胞增多性李斯特菌灭活疫苗的免疫增强效果

为增强单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)灭活疫苗的免疫效果,对单增李斯特菌入侵相关蛋白(P60)基因进行了克隆、表达及纯化,分别与低剂量李斯特菌溶血素O(LLO)、单增李斯特菌灭活菌混合,以MontanideISA206为佐剂制成疫苗,皮下接种家兔,并设灭活疫苗免疫组和PBS对照组,定期检测3组家兔的血清抗体、IL-4和IFN-γ水平的变化;二免后第21d每只家兔腹腔注射2×108CFU单增李斯特活菌攻毒,观察各组家兔的发病情况,每隔24h检测一次细菌在各组家兔体内的繁殖率。结果表明,添加P60和低剂量LLO重组蛋白的单增李斯特菌灭活疫苗免疫组家兔二免后抗体水平明显高于其他各组,且能诱导Th细胞向Th1型分化,抑制Th2型细胞的分化,调节抗原特异性免疫应答,能有效抵抗单增李斯特菌的感染,使细菌在家兔体内(外周血、脾)的几何增长率从64.69%降到24.06%,免疫效果明显优于灭活疫苗单独免疫组。证明P60和低剂量LLO能增强灭活疫苗的免疫保护效果。     

牛源纹带棒状杆菌的分离鉴定及其耐药基因与agr管家基因的检测

首次于牛鼻拭子中分离得到1株优势菌株,经16S rRNA鉴定该菌为纹带棒状杆菌。动物回归试验、小鼠致病性试验结果显示,该菌具有一定的条件致病性。药敏试验与耐药基因检测结果显示,该菌四环素耐药基因与大环内酯类药物耐药基因均呈显性表达。PCR检测结果显示,该纹带棒状杆菌存在毒力相关基因——agr管家基因(accessory gene regulator)。     

耐药基因cfr和optrA在猪源葡萄球菌的流行特征

为了解多重耐药基因cfr、optrA在猪源葡萄球菌中的流行分布,对来自广东省河源市和上海市3个猪场的280份鼻腔拭子样品,使用氟苯尼考(10μg/mL)甘露醇平板进行细菌分离,PCR检测cfr和optrA耐药基因,并通过gap基因进行菌种鉴定,采用琼脂稀释法对16种常用抗菌药物进行药敏试验。结果显示,本研究共分离获得38株葡萄球菌(分离率为13.57%),包括25株cfr阳性菌株(检出率为8.93%)和15株optrA阳性菌株(检出率为5.36%),其中2株葡萄球菌同时检出cfr及optrA基因。gap基因鉴定表明,15株optrA阳性葡萄球菌均为松鼠葡萄球菌,23株cfr阳性葡萄球菌成功分为4个不同葡萄球菌亚种,包括12株松鼠葡萄球菌、8株腐生葡萄球菌、2株马胃葡萄球菌及1株科氏葡萄球菌。药敏结果显示,38株cfr/optrA葡萄球菌均为多重耐药菌株,均对氟苯尼考、克林霉素和泰妙菌素耐药,且对部分药物表现出较高耐药率,如沃尼妙林(94.7%)、氨苄西林(92.0%)及四环素(89.5%),但所有菌株对万古霉素敏感。对比在不同生长阶段分离葡萄球菌中cfr及optrA的检出率,cfr和optrA基因主要流行于育肥猪。结果表明,3个猪场葡萄球菌cfr和optrA的检出率高,耐药情况严重,应加强抗菌药物在养殖过程中规范使用以减缓耐药性的产生和传播。     

多重耐药基因cfr在食品动物源大肠杆菌中流行特点的调查

为调查多重耐药基因cfr在我国多个地区食品动物源大肠杆菌中的流行情况及耐药现状,对2014年从广东、山东、江苏等11个省份分离得到的4 702株大肠杆菌,采用PCR和测序方法验证cfr阳性菌株,并通过临床常用药物敏感性测定、脉冲场凝胶电泳分型(PFG E)和Southern杂交定位等方法,确定分离株的耐药表型和cfr基因在大肠杆菌中的传播方式。结果显示,共检出cfr阳性菌株9株,检出率为0.19%。药敏试验结果显示,9株cfr阳性菌株对氯霉素、氟苯尼考、氨苄西林、四环素、多西环素均耐药,对亚胺培南均表现为敏感,对庆大霉素、新霉素耐药率在60%以上,对其他药物耐药率介于10%~50%之间。PFGE结果显示,有2株来自同一养殖场的菌株谱型相似,表明存在克隆传播。Southern杂交结果显示,cfr基因定位于大小为70~400 kb之间的质粒上。上述调查结果表明,多重耐药基因cfr在食品动物源源大肠杆菌中的检出率较低,但在广东地区较为流行。     

猪链球菌耐药性的检测

采用药敏纸片扩散法、微量稀释法及双纸片扩散法对分离自长春地区的 2 2株猪链球菌进行了耐药性测定。结果表明 ,82 %～ 10 0 %的菌株对大环内酯 林克酰胺 链阳菌素B(MLSB)类、四环素类、氟喹诺酮类、氯霉素类、氨基糖苷类耐药 ,但对青霉素和氨苄青霉素不耐药 ,对利福平的耐药率为 5 % ;82 %的菌株为多重耐药 (MDR) ;91%的菌株为MLSB 型耐药 ,其中构成型耐药占95 %。除青霉素外 ,其他 5种抗生素的MIC50 和MIC90 高度集中 (≥ 12 8μg/mL)。     

水源性肠球菌对苯扎溴铵及部分抗菌药的耐药性研究

为了解水源性肠球菌对抗菌药和苯扎溴铵的耐药现状,为后期的用药提供新的方向和理论依据。运用肠球菌选择培养基和多重PCR法对福建省部分河流和猪场环境中的水源性肠球菌进行分离和种水平鉴定,采用微量肉汤法测定分离菌株的MIC值,并且用PCR方法检测16种相关抗性基因。结果显示,福建省部分地区水源性肠球菌的分离率为71.43%,其中粪肠球菌占41.33%、屎肠球菌占14.67%;多重耐药率为74.67%,对红霉素的耐药率最高,为81.33%,其次为四环素74.67%,对氨苄西林和万古霉素较敏感,耐药率仅为4.00%和2.67%;有22.67%的分离菌对苯扎溴铵的MIC值高于标准菌;共有9种抗性基因被检出,其中gyrA基因的检出率最高,为93.33%,其次是tetL基因,也高达80.00%。结果表明,福建省部分地区水源性肠球菌分离率较高且多重耐药现象严重,粪肠球菌为优势菌,且耐药率高于屎肠球菌,携带多个抗性基因是导致分离菌株对抗菌药物产生耐药性的主要原因,分离菌整体对苯扎溴铵较敏感,耐受水平低。     

耐氟喹诺酮类药物空肠弯曲菌HRM快速检测方法的建立

针对空肠弯曲菌介导氟喹诺酮类耐药决定区gyrA基因C-257-T位点突变,探讨高分辨率熔解曲线技术对其检测的可行性。选择gyrA基因已经被测序的菌株NCTC11168和ZP11作为高分辨率熔解曲线法的标准阴性和阳性菌株,建立评价高分辨率熔解曲线方法的阴性和阳性标准。利用该技术对已知氟喹诺酮类耐药表型的55株菌株进行检测,结果45株与耐药表型鉴定结果一致,准确率达到81.81%。高分辨率熔解曲线技术检测耐氟喹诺酮类药物空肠弯曲菌gyrA基因C-257-T位点突变具有简单、快速、无污染等优点,有望成为临床检测筛选高耐氟喹诺酮类药物空肠弯曲菌的优选方法。