PADV3自然感染猪组织中病毒含量的实时荧光定量PCR检测

为了解猪腺病毒3型(PADV3)在自然感染猪体内不同器官组织中的分布情况,利用实时荧光定量PCR检测方法,定量检测了自然感染PADV3的仔猪、妊娠母猪以及与猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染的仔猪不同器官组织中PADV3病毒的含量。结果,在感染的猪体多种器官组织中均可检测到PADV3,但是在各器官组织中病毒的含量有差异,其中肠黏膜、肺组织、肠系膜淋巴结、扁桃体中病毒含量较高,心、肝、脾组织中病毒含量较低;在同时混合感染PCV2的仔猪肺组织、肠系膜淋巴结、扁桃体中PADV3含量显著增加。结果表明,PADV3对猪肠黏膜、肺组织、肠系膜淋巴结、扁桃体有较强的嗜性,对心、肝、脾组织的嗜性相对较弱;PCV2混合感染可促进PADV3在仔猪体内的增殖,能增强PADV3对感染器官组织的亲嗜能力。     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型猪体共感染发病模型的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)多以混合感染的形式,广泛存在于世界各地的猪群。本研究选取35日龄的阴性健康猪,随机分为4组:PCV2感染组(n=5)、PCV2+PRRSV共感染组(n=5)、PRRSV感染组(n=5)和空白对照组(n=4)。攻毒后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重并于不同时间采血,攻毒后第21天剖杀所有猪,荧光定量PCR检测血清中病毒血症和组织中病毒载量。结果表明,PCV2+PRRSV共感染组猪的临床症状最严重,并死亡2头。病理变化主要表现为肺出血、明显的间质性肺炎,淋巴组织及淋巴细胞缺失严重,淋巴滤泡中出现大量核浓缩深染的淋巴细胞;PCV2单独感染组与PRRSV单独感染组猪的临床症状轻微,仅出现短暂性体温升高;空白对照组未出现症状。病毒血症检测结果显示,两种病毒共感染组猪的血清中PCV2与PRRSV含量均高于单独感染组。本研究成功建立了PRRSV与PCV2猪体人工共感染发病模型,为PRRSV与PCV2协同致病机理研究奠定了基础。     

广西猪圆环病毒2型全基因组进化分析

为了调查近几年广西猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株的遗传变异趋势,为猪圆环病毒病(PCVD)的有效控制提供理论指导,对广西不同地区送检的病死保育猪肺及淋巴结样品进行PCV2检测和全基因扩增。应用Laser Gene 7.1和M EGA 4.1软件对PCV2全基因序列进行核苷酸同源性和遗传进化分析,并对开放阅读框(ORF2)氨基酸位点变异进行分析。结果显示,从阳性病料中成功扩增出12条PCV2全基因序列,其中6条PCV2序列属于PCV2d基因型,另外6条属于PCV2b基因型。不同基因型ORF2氨基酸序列分析显示,PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d各个基因型的ORF2氨基酸序列上的位点具有其独特性。本研究发现,近年来广西地区猪群PCV2d基因型的感染病例增多,有可能会替代PCV2b或者与PCV2b共同成为广西地区的主导基因型。     

猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.     

猪圆环病毒1型抗体IPMA检测方法的建立及应用

建立了一种用于检测猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法.对该方法的反应条件、特异性、敏感性及重复性等进行了系统试验,并与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测结果进行了比较.结果显示,用IPMA法对已知PCV1和猪圆环病毒2型(PCV2)参考阳性血清进行检测,血清稀释度≥1:100即可消除2种病毒间的低水平交叉反应,与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应;与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测符合率为88.9%.用该方法对黑龙江省、吉林省、河北省、上海市、辽宁省等地猪场送检的257份血清样品进行检测,PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%和80.5%,PCV1抗体阳性猪中有95.9%为PCV2阳性,表明我国猪群已存在PCV1感染,在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在.建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点,不失为PCV1流行病学调查及血清抗体检测的有效技术手段.     

伪狂犬病病毒变异株Fujian-LY对生长育肥猪的致病性研究

将6头80日龄伪狂犬病病毒(PRV) g B、g E抗体均为阴性的生长育肥猪随机分成对照组和感染组,每组3头。感染组试验猪通过颈部肌肉接种Fujian-LY株2m L,对照组猪经相同途径接种等体积的DMEM,每日观察记录试验猪的发病及死亡情况,试验期为7 d。结果显示,感染组育肥猪临床症状表现明显,在感染1 d后体温均开始升高,随着病情的发展,表现咳嗽、喘气、流鼻涕等典型的呼吸道症状,至试验结束未出现死亡。病理剖检显示,与对照组相比,感染育肥猪除脑部病变明显外,心、肝、脾、肺、肾等主要器官组织均未出现明显的肉眼可见病变。组织病理学检查结果显示,PRV Fujian-LY株已对感染育肥猪的多个主要器官组织造成了较为严重的病理损伤:脑实质中小血管扩张充血,血管周围有淋巴细胞包围的"血管套"现象;肝索紊乱、肝细胞坏死;免疫器官中淋巴细胞减少等。同时采用PCR及免疫组织化学方法对这些组织进行检测均呈PRV阳性。g B、g E抗体检测结果显示,感染猪在感染后第7天PRV g B、g E抗体均开始转阳。上述结果表明,PRV Fujian-LY株对生长育肥猪具有较强的致病性,在发病猪体内分布广泛。     

猪圆环病毒2型感染裸鼠及BALB/c小鼠的研究

用猪圆环病毒2型(PCV2)经腹腔注射BALB/c小鼠及裸鼠各15只,每隔2周1次,共感染3次。BALB/c小鼠初次、再次感染后均未出现明显的临床症状,仅有2只小鼠出现病理变化;从血清中可检测到PCV2核酸及其ORF2抗体;同时淋巴细胞增殖反应显著增强,NK和CTL细胞杀伤率显著升高;CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞及CD19+B淋巴细胞数量显著减少。裸鼠也未出现明显的临床症状,从血清中可检测到PCV2核酸,但未检测到PCV2 ORF2抗体;除NK细胞杀伤率显著升高外,其余免疫学指标无显著改变。结果表明,BALB/c小鼠比裸鼠对PCV2易感,各项免疫学指标变化与PCV2感染猪一致,但不表现临床症状,仅个别BALB/c小鼠出现病理变化,说明BALB/c小鼠对PCV2不如猪易感。     

西宁市猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了西宁市8个规模养殖场和部分散养户的161份猪血清样品的猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果显示,所有被检猪场均有PCV2抗体阳性猪存在,161份血清样品中PCV2抗体阳性率为86.95%。从上述样品中随机抽取28份样品,用PCR方法检测了PCV2 ORF1基因;结果,从13份血清中扩增到了特异性PCV2 ORF1基因,阳性率为46.42%。证实,西宁市猪场和散养猪群中存在PCV2感染。     

人工感染仔猪猪生殖与呼吸综合征病毒的核酸分布规律

根据猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株ATCC VR-2332保守区ORF6和ORF7的基因序列,设计了1条37 bp的寡核苷酸探针,末端用生物素标记.应用原位杂交方法对人工感染PRRSV SC-1株的28日龄仔猪进行了病毒核酸分布规律的研究.结果显示,感染后7～28 d于肝、脾、肺、肾、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、肠和大脑检测到阳性杂交信号,其中肺门淋巴结的阳性信号一直较强,脾的阳性信号逐渐增强,肺的阳性信号较弱,心脏未见阳性杂交信号.     

猪细小病毒、猪圆环病毒2型和伪狂犬病病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)核苷酸序列,分别设计并合成了3对特异性扩增PPV、PCV2和PRV的引物,扩增片段长度分别为531、466和277bp。经过优化条件,建立了检测PPV、PCV2和PRV的多重PCR方法。采用该PCR方法对23份自然感染病猪样品进行检测,结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果的符合率为100%,同时对临床样品中PPV、PCV2和PRV阳性PCR产物进行测序分析,发现PPV、PCV2和PRV的PCR产物序列与GenBank中公布序列的同源性均达98%以上,证实该多重PCR检测的阳性结果为上述3种病毒。表明,建立的多重PCR方法可用于这3种病毒的临床诊断和流行病学调查。     

鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR的建立与应用

为了快速鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)的2个基因型PCV2a与PCV2b,根据PCV2a和PCV2b基因序列特征,设计PCR引物,成功建立了鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR,并进行了敏感性试验和特异性试验。结果显示,该方法对PCV2a和PCV2b的敏感性分别为9.74fg/μL和16.3fg/μL;与猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等没有交叉反应性。用该方法对采自我国华东地区的125份断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的淋巴组织样品进行检测,结果显示,单独感染PCV2a占8.0%(10/125),PCV2b占41.6%(52/125),PCV2a或PCV2b共感染占50.4%(63/125)。选取PCV2a或PCV2b单独感染的淋巴结组织病料进行病毒分离和全基因序列分析,结果分离获得4株PCV2b和1株PCV2a,与该鉴别PCR的检测结果一致,说明本研究建立的PCR可以有效鉴别PCV2a与PCV2b,具有较高的特异性和敏感性,可用于断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的临床样品中PCV2的快速检测。     

猪瘟病毒感染的小型猪体内病毒的复制情况及淋巴细胞变化

用106 TCID50CSFV石门株感染巴马小型猪,通过监测被感染猪的临床体温、观察其病理变化、检测猪瘟病毒在体内的复制情况、检查猪瘟病毒感染后对外周血淋巴细胞增殖的影响,并分析外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的动态变化,以确定巴马小型猪对CSFV的敏感性。结果,攻毒后第3天被感染的巴马小型猪出现病毒血症,并在第7天就已达到1×106 copies/μL以上;腹股沟淋巴结中病毒含量最高,颌下淋巴结次之。淋巴细胞增殖试验表明,用固定剂量的刀豆素刺激,被感染的巴马小型猪外周血淋巴细胞增殖出现不同程度降低;其外周血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的比例降低。结果表明,巴马小型猪可以作为CSFV的感染模型。     

猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立

根据已发表的PCV 1和PCV 2全基因组序列 ,设计了 3条引物 ,组成PCV 2的特有引物对和PCV 1、PCV 2的共有引物对 ,分别扩增长度为 4 72bp和 339bp的片段。为验证PCR扩增的特异性 ,将 4 72bp的扩增产物纯化后 ,克隆到 pMD 18 T载体 ,转化大肠埃希氏菌TG1,对阳性克隆进行酶切及PCR鉴定 ,并测序。将该序列递交NCBI进行BLAST同源序列比较 ,发现它与美国、加拿大及我国台湾的PCV 2毒株核苷酸序列的同源性均在 99%以上 ,与PCV 1毒株的同源性为 86 %。结果显示 ,该方法最少可用于 3μg病料组织和 0 .75 pgDNA的PCV 2检出 ,具有很高的灵敏性。应用该PCR方法检测了浙江省和上海市 4 7份“猪高热综合征”病料 ,PCV 2感染阳性率为 36 .17% ,PCV 1单独感染阳性率为 34.0 4 %。     

应用间接免疫荧光试验检测猪圆环病毒抗体

用猪肾传代细胞系PK 15增殖猪圆环病毒 2型 (PCV 2 )毒株制备抗原 ,建立了检测PCV抗体的间接免疫荧光试验 (IFA)。应用该方法对 64份临床送检血清样品进行了检测。结果 ,3 8份血清呈现PCV抗体阳性 (5 9% )。IFA方法的建立为临床上进行PCV流行病学调查及相关疾病的诊断提供了另一种检测手段。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR变异株第125代的毒力试验

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/mL)经肌肉注射和滴鼻途径接种18头35日龄PRRSV抗体阴性猪,同时设未接种对照组。结果试验猪未出现明显的临床症状。用RT-PCR法检测试验猪血清,从第3天开始出现阳性,第7～14天达到高峰,第28天后转为阴性。对同一时间迫杀的试验猪检测各脏器组织中的病毒抗原分布情况,结果表明,感染后第7～14天试验猪多数脏器呈阳性反应,第21～42天病毒集中在脾、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结等组织。病理学观察发现,第7～14天试验猪淋巴结及肺出现轻度病变。动物感染试验表明,尽管试验猪未显示明显的临床症状,但从病毒血症、病毒体内分布、病理变化等方面看,该毒株仍然具有一定的毒力,用于弱毒疫苗的研制还有待进一步驯化致弱。     

猪博卡病毒5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪博卡病毒5型NS1基因序列设计引物,建立了基于SYBR GreenⅠ的用以检测猪博卡病毒5型的实时荧光定量PCR。用该方法检测猪博卡病毒5型NS1基因,在3.64×102~3.64×107 copies/μL范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,Tm值为(83.12±0.12)℃,对猪圆环病毒(PCV1和PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪输血传播病毒(TTV1和TTV2)的核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.35%~1.24%,组间变异系数为0.43%~1.46%。此方法的建立为定量分析猪博卡病毒5型感染猪的感染程度和靶器官提供了精确检测手段。     

PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ATCC VR 2332 株人工单独感染3 头3 周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR 2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2 头3 周龄仔猪,每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现,并用HerdChek IDEXX 试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀,对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明,用所获得的3 株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外,用IIF检测7 头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片,其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应;对这2头猪的肺组织进行病毒分离,在盲传到第4代时Marc 145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠,且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。