山羊痘病毒感染的OFTu细胞的超微结构观察和宿主细胞中山羊痘病毒的形态学观察

用山羊痘病毒福建分离株GTPV-FZ株感染绵羊胚胎鼻甲(OFTu)细胞,制作超薄切片,透射电镜观察宿主细胞的超微结构和细胞中病毒形态的动态变化规律。结果显示,被感染细胞的超微结构表现为细胞质空泡增多,内质网扩张呈囊状且囊腔内充满絮状物,池内分离,可见细胞凋亡早期改变;线粒体增生、脊肿胀、变暗、模糊不清;高尔基体出芽;最后感染细胞被病毒破坏、溶解,可见残留病毒的包涵体。病毒粒子呈圆形或卵圆形,有囊膜,大小为250~350nm,可见两面凹陷呈哑铃形的核酸芯髓和2个侧小体结构。病毒在细胞质中复制、增殖,装配好的病毒以细胞膜出芽和细胞溶解方式释放病毒粒子。上述结果有助于全面认识山羊痘病毒的形态特征以及病毒与宿主细胞的相互作用。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株的分离鉴定

为获得1株猪伪狂犬病病毒贵州分离株,将贵阳市某猪场送检的流产胎儿病料经一系列处理后接种Vero细胞,并对分离毒株分别进行了病毒理化特性、电镜形态观察、中和试验、动物接种试验、核酸检测等鉴定。当盲传至第3代时,出现细胞变圆变亮、脱落、呈拉网状特征的细胞病变;分离毒不耐酸和热,对5-碘脱氧尿核苷和有机溶剂氯仿敏感,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;透射电镜下可见位于囊泡中呈近圆形、有囊膜、150～180 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;将分离毒株接种家兔,能引起家兔奇痒、麻痹死亡;PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株。     

携带BAC质粒DNA序列的重组伪狂犬病病毒变异株的构建和鉴定

本研究旨在以当前流行的伪狂犬病病毒变异株(TJ株)为基础,构建携带红色荧光蛋白(RFP)标记细菌人工染色体质粒的重组伪狂犬病病毒(PRV)。通过同源重组和Cre/lox P特异性位点重组的方法构建了重组病毒r PRVTJ-del TK-BAC-RFP株。PCR鉴定和测序分析结果表明,在重组病毒r PRVTJ-del TK-BAC-RFP株的基因组中已插入RFP标记的BAC质粒DNA序列;动力学参数分析表明,重组病毒的生长特性与PRV TJ株相似,尽管复制能力稍有降低,但与亲本株相比并无显著性差异;电镜检测结果显示,重组病毒与亲本病毒PRV TJ株的病毒粒子极其相似,均有囊膜,核心约为80 nm,核衣壳清晰可见。这为进一步研究PRV的变异机制奠定了基础。     

牛流行热病毒的研究——病毒形态与理化特性

研究了从北京分离的牛流行热病毒的北76AMH毒株(牛沉鼠毒适应在BHK_(21)细胞系上的毒株)的主要特性。证明该病毒是RNA型,在宿主细胞质内装配,以出芽方式从细胞中释放并成熟。成熟病毒粒子呈典型弹状,大小为85nm×170nm。毒粒外面有厚11nm的囊膜及囊膜小体。病毒对有机溶剂和胰蛋白酶敏感,能耐受反复多次的冰冻—融化处理而不降低其感染力。初步测定了保存在不同温度条件下病毒的灭活情况。根据上述特征以及流行病学资料,该病毒与国外报道的牛暂时热病毒是一致的,而与某些在临床症状上相似的牛流行病病毒如牛蓝舌样病毒、牛鼻气管炎病毒和牛呼吸道合胞体病毒却有本质的区别。     

鸭肿头出血症病毒强毒的致病性及感染组织细胞的超微病理变化

将鸭肿头出血症病毒(DSHDV)强毒株以不同途径接种10日龄鸭胚,研究了病毒在鸭胚中的繁殖规律,并用透射电镜观察了感染鸭胚各组织器官的超微结构变化,同时用DSHDV人工感染不同日龄雏鸭,比较了不同感染途径对雏鸭的致病性和对不同日龄雏鸭的致病性。结果显示,尿囊腔和卵黄囊2种途径均能使病毒在鸭胚上繁殖并传代,对鸭胚的半数致死量分别为10-7.24/0.2 mL和10-6.4/0.2 mL。病毒感染鸭胚后,电镜下可观察到肝和尿囊膜中的病毒粒子,病毒粒子呈球形或椭圆形,大小为60~80 nm,无囊膜;病毒在细胞浆内复制,可形成特征性包涵体;病毒侵害的主要靶器官为尿囊膜与肝,细胞器的变化主要表现为粗面内质网扩张以及线粒体肿胀和嵴断裂、消失。病毒经肌肉注射、口服和滴鼻均能使28日龄鸭感染发病,致死率分别为86%、89%和97%。研究表明,DSHDV能很好地在鸭胚上生长并致鸭胚各组织器官超微结构发生变化,不同感染途径均能使雏鸭感染发病且致病性强。     

浅谈兽医病毒(续)

(四)彩虹病毒科(Iridoviridae)受本科病毒感染的幼虫或病毒颗粒离心沉聚在一起,外观上呈现彩虹色,故名。本科病毒颗粒呈球形,直径130～300nm,二十面体对称基因组为双股DNA,遗传机制类型为±DNA→mRNA。有或无囊膜,感染脊椎动物的病毒有囊膜,对乙醚等有机溶剂敏感;感染节肢动物的病毒无囊膜,对乙醚不敏感。病毒在细胞质内增殖。     

变异猪伪狂犬病病毒自然感染仔猪的病理组织学研究

为了解伪狂犬病病毒(PRV)变异株对自然感染仔猪的组织病理损伤,对自然感染发病仔猪进行病理剖检、细菌分离、病毒PCR鉴定、病毒分离培养、病毒粒子观察、基因序列分析及病理组织学观察,证实该发病仔猪为典型的PRV病毒变异株感染发病。病理剖检和病理组织学检查结果显示,发病仔猪脑、心脏、肝、脾、肺、肾等主要器官组织可见典型的猪伪狂犬病剖检病变和病理组织学变化。脑实质中小血管扩张充血,大量胶质细胞浸润,形成明显的血管套和噬神经元现象;肝索紊乱、肝细胞坏死;全身免疫器官淋巴细胞减少等。同时发现PRV在发病仔猪全身分布广泛,且组织中病原含量与组织病理损伤程度密切相关。结果表明,自然发病仔猪感染的PRV变异毒株属于强毒株,具有较强的致病性。     

人工感染白斑综合征病毒的克氏原螯虾的病理学试验

用从发病中国对虾体内提取的白斑综合征病毒 (WSSV )人工感染克氏原螯虾 ,被感染克氏原螯虾均发病死亡。光学显微镜下观察病螯虾的组织切片 ,发现其胃、鳃等的上皮组织以及结缔组织的细胞核明显肿大和嗜伊红染色 ;电镜观察超薄组织切片 ,发现病螯虾的胃部、鳃部组织的细胞核内有大量的杆状病毒样病毒粒子 ,该病毒粒子有囊膜 ;斑点杂交检测发病螯虾 ,阳性率为 10 0 % ;人工感染克氏原螯虾的角化上皮、胃上皮、肝胰腺上皮、疏松结缔组织、肌肉、造血组织和鳃 ,经原位杂交检测呈阳性。     

新疆绵羊进行性肺炎病毒与山羊关节炎脑炎病毒形态研究

新疆绵羊进行性肺炎病毒(OPPV)和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)是有致密核心的粒子,在细胞培养中从感染宿主细胞的浆膜上以出芽方式繁殖,在基因组的5’末端及部分3’末端存在双层膜结构的颗粒。成熟的病毒呈球形、椭圆形,直径80～120nm,个别可达140nm。有一层包围内核的壳膜,壳膜由双层脂质内层和糖蛋白外层组成。     

实验小鼠多房棘球蚴及化疗后的形态学观察

本文对实验性小鼠正常多房棘球蚴以及应用西药丙硫咪唑、中药(消包丸)、中西药治疗等条件影响下的多房棘球蚴进行光、电镜观察。光镜观察结果,小鼠正常多房棘球蚴角质层板层纹理不明显,生发膜由2～3层细胞构成。囊腔内有大量原头节和育囊。经过药物治疗的小鼠多房棘球蚴都出现角质层和生发膜变薄,生发膜细胞变性坏死,囊腔内无原头节或育囊,PAS阳性反应减弱或消失。透射电镜观察结果,正常多房棘球蚴角质层由疏松排列的纤维和颗粒构成。生发膜有大量发育良好的微毛伸入角质层内,皮层区有许多具有单位膜的空泡及少量微管。皮层细胞区主要由皮层细胞和肌细胞构成。经过药物治疗后角质层纤维和颗粒数量减少,甚至完全消失,是透明状。生发膜微毛变得粗短或消失,皮层空泡增多,微管扩张破裂,线粒体固缩,高尔基体与粗面内质网解体,胞浆内出现大量脂滴,严重时生发膜细胞变性坏死形成髓样物质、不定形物质。病理变化以中西药治疗组最明显,其次是西药和中药组。     

人工感染PRRSV仔猪肺和子宫细胞凋亡的电镜观察

应用透射电子显微镜对仔猪感染猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)后不同时期肺和子宫凋亡细胞的超微形态结构进行了观察。结果表明,PRRSV可诱导宿主肺和子宫发生典型的细胞凋亡,表现为细胞的超微形态结构随着病毒感染进程出现不同的特征性变化,早期(感染后第8 h至第3 d)凋亡细胞多表现为细胞体积缩小,细胞质密度增强,染色质浓缩,核仁解体,内质网扩张;中期(感染后第5 d至第9 d)凋亡细胞体积显著缩小,细胞膜突起,线粒体增多,有凋亡小体形成;晚期(感染后第10 d以后)凋亡细胞形态多表现为凋亡小体降解和消失,少数凋亡细胞在凋亡晚期表现为坏死细胞。肺细胞凋亡主要发生于肺巨噬细胞和肺泡上皮细胞,子宫细胞凋亡主要发生于子宫内膜细胞和内膜腺细胞。     

猪伪狂犬病病毒JSZ株的分离鉴定及其病毒核酸的分布规律

用猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性引物对江苏省某猪场疑似猪伪狂犬病的病死仔猪组织病料进行了PCR鉴定,结果可扩增到特异性的条带.用该病料接种PK-15细胞,24 h即出现细胞病变,PCR和间接免疫荧光试验结果均证明所分离病毒为PRV.用该PRV分离株接种兔后出现奇痒症状并麻痹致死;接种仔猪后出现持续发热,肌肉震颤等症状.通过对自然感染PRV病死仔猪脏器进行PCR检测,发现PRV在仔猪体内广泛分布,其中以脾的检出率最高,可达100%;对人工感染猪的直肠和鼻腔棉拭样品进行PCR检测,发现病猪排毒最长可达13 d.证实,该分离株为猪伪狂犬病强毒株,脾为病毒检测的首选靶器官.     

绵羊睾丸支持细胞的分离鉴定及其在山羊痘病毒疫苗株培养中的应用

为研究绵羊睾丸支持细胞对山羊痘病毒的增殖特性,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步法分离绵羊睾丸支持细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察、细胞染色鉴定以及特异性表达ABP蛋白鉴定,然后接种山羊痘病毒疫苗株。结果显示,分离的原代细胞24 h可长满单层,用0.05%的胰酶消化处理3次可得到纯度约为80%的睾丸支持细胞;油红O染色可观察到绵羊睾丸支持细胞的细胞质含有大量脂肪滴,细胞核可见双极小体;HE染色后细胞核为蓝色,细胞质呈红色或粉红色。ABP蛋白间接免疫荧光可观察到在绵羊睾丸支持细胞的细胞质和细胞核周围有绿色荧光,经显微镜下计数其纯度达80%以上。接种山羊痘病毒疫苗株后第4天有90%细胞产生病变,细胞变圆,细胞聚集成簇状,细胞收缩、细胞核出现空泡化。qPCR扩增Ct值为18.81,Ct值低于其他细胞传代数值。结论,本研究成功分离培养了绵羊睾丸支持细胞,该细胞能较好地培养山羊痘病毒疫苗株,对羊痘疫苗的生产有一定的现实意义。     

适合鸭瘟病毒弱毒增殖的MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立

为了建立适于鸭瘟病毒(DPV)弱毒增殖的细胞系,利用4个主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭品系,体外分离鸭胚肝细胞,在干细胞因子、白细胞抑制因子和成纤维细胞生长因子诱导下,获得鸭胚肝间充质干细胞(DuLMSC)。接种DPV疫苗株C-KCE后,结果显示:F1~F10代均能稳定出现CPE;将F10病毒接种细胞24 h后,通过扫描电镜在胞质、胞核及细胞间隙均能够观察到典型的疱疹病毒粒子;F1至F10代均能扩增出DPV UL2基因片段,序列测定结果表明F1、F5、F10代的扩增产物与NCBI中公布的DPV株(EU082088)的核苷酸同源性为100%;组织培养半数感染量和一步生长曲线结果表明,源自B4系单倍型鸭的DuLMSC细胞系增殖DPV的病毒含量明显高于B1、B2和B3系。本研究为稳定培养鸭瘟病毒提供了优良稳定的实验材料。     

SABC法对伪狂犬病病毒鄂A株在仔猪体内的定位

运用免疫组织化学SABC法对人工感染伪狂犬病病毒的仔猪部分组织进行组织学观察。结果显示,在肺、大脑、小脑、脊髓、脊神经节、淋巴结、扁桃体、胸腺、脾、肝、肾、肾上腺、胃、肠等组织内均发现阳性细胞,尤其在肺、神经组织和淋巴组织内为多,病毒主要侵害上皮细胞、神经细胞和淋巴细胞,主要存在于被感染细胞的胞浆和胞核内,但以胞浆内为主。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

禽骨髓细胞瘤病自然病例的病理学研究

对禽骨髓细胞瘤病显性型病鸡、ELISA阳性的隐性型病鸡和阴性对照鸡进行了病理学研究。结果表明 ,临床症状明显的显性型病鸡肝、脾、肾、睾丸 (或卵巢 )、肺等组织有灰白色结节状病灶和不同程度的肿胀 ,甚至在股骨或肋骨等处出现大小不一的硬固肿块 ,镜检病变部位有大量髓细胞样瘤细胞 ,呈典型的骨髓细胞瘤病的病理特征。电镜下瘤细胞病变明显 ,瘤细胞胞膜下疑似病毒样粒子 ;在自然病例肾悬液感染的鸡胚成纤维细胞培养物中巨噬细胞的膜性结构上发现增殖的病毒样凸起。ALV JELISA抗体检测试剂盒检出阳性、无明显临床症状和眼观病变的隐性型病鸡 ,光镜下骨髓、肝、卵巢、心肌等组织中可见与显性型相同的髓细胞样瘤细胞 ,但数量较少。ELISA抗体检测阴性对照鸡骨髓中胞浆含有嗜酸性颗粒的髓细胞明显少于阳性鸡 ,除在肝、卵巢等组织中偶尔出现外 ,其他组织很少见到。     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。