猪伪狂犬病病毒变异株感染绵羊胚胎鼻甲上皮细胞的病毒形态发生和细胞超微结构观察

应用超薄切片和透射电子显微镜技术,研究猪伪狂犬病病毒(PRV)MQ18变异株感染绵羊胚胎鼻甲上皮细胞(OFTu)的病毒形态发生和超微结构变化。结果显示:病毒在细胞核内复制、增殖,形成核内包涵体,装配好的病毒通过核内膜获得初始囊膜,以出芽方式出核进入细胞质,在高尔基体区域进行加工修饰、二次获得囊膜后形成完整病毒粒子,以包裹有病毒粒子的空泡与细胞膜相互融合方式,将病毒释放到细胞外;细胞超微结构主要表现为细胞质内空泡增多,线粒体增生、肿大,空泡样变,粗面内质网扩张,高尔基体形态异常,细胞核染色质浓缩、边集,最后细胞破坏、裂解,可见细胞早期凋亡及自噬小体结构。本研究结果为阐明PRV的感染和致病机制提供了理论依据。     

绵羊睾丸支持细胞的分离鉴定及其在山羊痘病毒疫苗株培养中的应用

为研究绵羊睾丸支持细胞对山羊痘病毒的增殖特性,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步法分离绵羊睾丸支持细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察、细胞染色鉴定以及特异性表达ABP蛋白鉴定,然后接种山羊痘病毒疫苗株。结果显示,分离的原代细胞24 h可长满单层,用0.05%的胰酶消化处理3次可得到纯度约为80%的睾丸支持细胞;油红O染色可观察到绵羊睾丸支持细胞的细胞质含有大量脂肪滴,细胞核可见双极小体;HE染色后细胞核为蓝色,细胞质呈红色或粉红色。ABP蛋白间接免疫荧光可观察到在绵羊睾丸支持细胞的细胞质和细胞核周围有绿色荧光,经显微镜下计数其纯度达80%以上。接种山羊痘病毒疫苗株后第4天有90%细胞产生病变,细胞变圆,细胞聚集成簇状,细胞收缩、细胞核出现空泡化。qPCR扩增Ct值为18.81,Ct值低于其他细胞传代数值。结论,本研究成功分离培养了绵羊睾丸支持细胞,该细胞能较好地培养山羊痘病毒疫苗株,对羊痘疫苗的生产有一定的现实意义。     

贵州省山羊痘病例的病原学鉴定与病理学观察

为对近年来发生在贵州省部分地区疑似山羊痘的疫情做出确诊,取疑似山羊痘病羊皮肤及黏膜痘疹,处理后接种Vero-E6细胞,可观察到明显的细胞病变;反向间接血凝试验显示,细胞培养液血凝效价为22~25,阳性率达100%(5/5);以山羊痘病毒P32基因的1对特异性引物,从9份痘疹样本(共10份)及2株分离株PCR扩增出963 bp的特异性DNA条带;取感染细胞培养物接种成年健康山羊,山羊出现了典型的临床症状和病理变化,接种10日龄鸡胚绒毛尿囊膜也能表现出明显的痘斑病变,痘斑出现率可达40%;病羊上皮细胞呈不同程度的水泡变性,胞浆内含多量嗜酸性包涵体;细胞内存在圆形或卵圆形、有囊膜、大小约为310 nm×204 nm的病毒粒子。结果表明,近年来发生在贵州省部分地区的山羊疫情是山羊痘所致。     

山羊痘病毒的鉴定及序列分析

以华中地区某山羊场疑似山羊痘病料为对象,进行了本动物病例复制、透射电镜观察、病理切片HE染色、特异性目的基因扩增和序列测定及遗传进化关系分析。结果,复制了山羊痘本动物模型,观察到山羊痘病毒(GTPV)样粒子,切片HE染色可见有炎性细胞浸润,病料中扩增到P32基因;序列测定及遗传分析表明,该病毒为山羊痘病毒(ZL/HB/HN),与2008年分离于印度的山羊痘毒株(FJ748488)的遗传关系最近,与中国山羊痘疫苗株(AY881707)及1978年分离于印度的山羊毒株(AY382869)同属一个进化分支。     

山羊痘直接荧光抗体检测方法的建立与应用

用兔抗山羊痘病毒IgG制备荧光抗体,检测了临床发病山羊皮肤痘疹切片和山羊痘病毒B、Y、LD和QL株感染的BHK-21细胞中的病毒抗原.结果,皮肤痘疹切片、感染细胞抹片及飞片均呈阳性,而正常山羊皮肤和细胞对照为阴性;荧光抗体的最适工作浓度为1∶32,且这种荧光可被山羊痘标准阳性血清特异性抑制.表明,建立的山羊痘直接荧光抗体检测方法能对临床发病山羊皮肤痘疹和感染细胞中的山羊痘病毒抗原进行定位检测,为临床诊断山羊痘提供了一种简单快速的方法.     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株的分离鉴定

为获得1株猪伪狂犬病病毒贵州分离株,将贵阳市某猪场送检的流产胎儿病料经一系列处理后接种Vero细胞,并对分离毒株分别进行了病毒理化特性、电镜形态观察、中和试验、动物接种试验、核酸检测等鉴定。当盲传至第3代时,出现细胞变圆变亮、脱落、呈拉网状特征的细胞病变;分离毒不耐酸和热,对5-碘脱氧尿核苷和有机溶剂氯仿敏感,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;透射电镜下可见位于囊泡中呈近圆形、有囊膜、150～180 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;将分离毒株接种家兔,能引起家兔奇痒、麻痹死亡;PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株。     

山羊痘病毒感染绵羊的诊断及其p32基因的分子分析

采用细胞培养方法从发生羊痘的绵羊肺组织中分离到1株山羊痘病毒GPV/GSgulang/09,对分离株的p32基因进行了PCR-RFLP和序列比对分析.结果显示,GPV/GSgulang/09株p32基因的扩增产物被Hinf I酶切后出现山羊痘病毒(GPV)特征性的2条带;p32基因序列第166～168位缺失绵羊痘病毒(...     

山羊痘病毒L1蛋白的原核表达及其功能分析

为了探究山羊痘病毒L1蛋白在病毒感染Vero细胞过程中的作用,将山羊痘病毒L1蛋白基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物。表达的目的蛋白经镍亲和柱纯化后免疫家兔制备了抗血清,通过蛋白封闭试验和血清抑制试验研究了纯化蛋白及其抗血清对山羊痘病毒感染的抑制作用。结果显示,成功表达了山羊痘病毒的L1蛋白,表达产物为48ku左右的重组蛋白,它能被山羊抗山羊痘病毒阳性血清识别。加入L1蛋白封闭,可使山羊痘病毒感染细胞的病变时间推迟12h,病毒与L1蛋白抗血清作用后效价下降了87.8%。结果表明,L1蛋白可能是山羊痘病毒的受体结合蛋白,并能在病毒侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。     

山羊痘病毒SERPIN蛋白抑制宿主细胞凋亡活性的鉴定

采用PCR扩增长为1 041bp的山羊痘病毒(GTPV)serpin基因,构建真核表达质粒pcDNA-Ser-pin;将其转染HeLa细胞,经G418筛选,克隆纯化、鉴定,获得1株稳定表达GTPV SERPIN蛋白的HeLa细胞株;然后通过检测凋亡诱导剂TNF-α和放线菌酮作用后的细胞形态学变化、细胞活力和caspase活性,对GTPV SERPIN蛋白抑制宿主细胞凋亡的活性进行了鉴定。序列分析结果表明,GTPV SERPIN与正痘病毒SPI-1和SPI-2的氨基酸序列同源性为36%～38%;与痘苗病毒SPI-2空间构型相近,VADC基序和P1氨基酸(天门冬氨酸)相同。细胞试验结果显示,GTPV SERPIN蛋白能抑制由TNF-α和放线菌酮诱导的细胞凋亡,抑制率达70%左右,且这种抑制作用与其下调细胞caspase-8活性有关。证实GTPV SERPIN能抑制宿主细胞凋亡,可能是GTPV的致病因子之一。     

牛流行热病毒的研究——病毒形态与理化特性

研究了从北京分离的牛流行热病毒的北76AMH毒株(牛沉鼠毒适应在BHK_(21)细胞系上的毒株)的主要特性。证明该病毒是RNA型,在宿主细胞质内装配,以出芽方式从细胞中释放并成熟。成熟病毒粒子呈典型弹状,大小为85nm×170nm。毒粒外面有厚11nm的囊膜及囊膜小体。病毒对有机溶剂和胰蛋白酶敏感,能耐受反复多次的冰冻—融化处理而不降低其感染力。初步测定了保存在不同温度条件下病毒的灭活情况。根据上述特征以及流行病学资料,该病毒与国外报道的牛暂时热病毒是一致的,而与某些在临床症状上相似的牛流行病病毒如牛蓝舌样病毒、牛鼻气管炎病毒和牛呼吸道合胞体病毒却有本质的区别。     

山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA复制非必需区的筛选

提取山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA,用HindⅢ酶切,随机克隆到pUC18质粒中,限制性内切酶片段电泳分析和序列测定结果表明,克隆到4个不同大小的HindⅢ片段pUA、pUB、pUC和pUD。随后,将它们和羊痘病毒Pellor(AY077835)株进行了同源性比较,发现核苷酸同源性为90.0%~94.5%,氨基酸同源性为83.0%~91.4%。选取克隆或亚克隆后的单一酶切位点,插入P11P7.5-LacZ报告基因,构建了pUA1、pUB1、pUC1和pUD1共4个重组载体质粒。通过脂质体分别转染山羊痘病毒感染的BHK-21细胞,在X-gal存在条件下经蓝白斑筛选重组病毒,获得1株重组病毒,证明筛选出了1个复制非必需区片段。     

电子显微镜对牛白血病病毒的观察

牛白血病病毒在成熟阶段,是以单层膜位于宿主细胞膜直下,此点与通常所说的C型粒子的“出芽”形态不同,C型粒子是以双层膜样结构位于宿主细胞膜直下。 牛白血病病毒核芯多为圆形,但也有杆型等其他种形态。整个病毒粒子直径平均为100nm,同时也存在150nm以上的粒子。这些病毒粒子大致由纤突、病毒膜、     

禽副粘病毒2型标准株和国内分离株的透射电镜及免疫电镜观察

将禽副粘病毒2型的标准毒株Yucaipa病毒和国内分离株F4、F6和F8株分别接种SPF鸡胚,收获鸡胚尿囊液;经差速离心和蔗糖密度梯度离心后,分别制备电镜样品和免疫电镜样品;经10 g/L醋酸双氧铀负染后电镜观察病毒粒子形态.电镜下病毒粒子大小差别较大,形态呈圆形或椭圆型,直径150-300 nm,有结构致密的基质蛋白膜,有的囊膜外可见纤突.免疫电镜样品中病毒明显集中,便于观察.     

小反刍兽疫病毒H基因或F基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究

为构建能够表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H基因或F基因的重组山羊痘病毒(GPV)并以此为活载体疫苗,在通用转移质粒pTKfpgigp的多克隆位点中插入PPRV的H基因或F基因,构建重组转移质粒pTKfpgigp-PPRV H和pTKfpgigp-PPRV F,并用Lipofectamine 2000转染已感染GPV的原代绵羊睾丸细胞,经同源重组产生重组GPV(rGPV)。用GFP和gpt选择标记筛选纯化rGPV,通过RT-PCR和免疫荧光技术检测rGPV在原代绵羊睾丸细胞中外源基因的表达情况。将获得的rGPV皮内接种山羊,检测抗山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒的特异性抗体的变化情况。结果显示,获得了含有PPRV H基因或F基因的病毒株rGPV-PPRV H和rGPV-PPRV F;在原代绵羊睾丸细胞中rGPV所含的外源基因进行了正常转录和翻译,表达产物能与PPRV抗血清产生特异性反应,动物免疫试验表明,2株rGPV能诱导产生高水平的抗山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒的特异性抗体。上述研究结果为PPRV重组标记疫苗的研制提供了参考。     

山羊痘病毒ORF014蛋白的结构预测及其真核表达

以山羊痘病毒古浪株基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得山羊痘病毒ORF014基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-His(-)B,通过脂质体法将重组质粒转入Vero细胞,Western-blot分析目的基因表达情况。使用WabLab、SWISS-MODEL和ExPASY等在线软件预测GTPV014蛋白的功能结构域和二、三级结构以及氨基酸组成,对其作为凋亡抑制蛋白的真实性、可靠性做出理论上的判断。结果显示,重组表达载体可以在Vero细胞中表达出大小约为20ku的重组融合蛋白,该蛋白具有与黏液瘤病毒M11L蛋白相似的一些结构特征。上述结果为GTPV014蛋白在山羊痘病毒感染过程中抑制凋亡的研究提供了一些理论依据。     

应用PCR检测山羊痘病毒

初步建立了用于诊断山羊皮肤组织中山羊痘病毒的PCR方法。试验设计了 2对引物 ,用以分别检测山羊痘病毒的特异性基因和α 微管蛋白基因。克隆到的DNA扩增产物的序列与GenBank中收录的序列同源性达到 98%。试验表明 ,用PCR方法可快速检测样品中的山羊痘病毒。     

扫描电镜对马传贫病毒感染细胞的观察

我们用透射电镜对马传贫病毒的观察,基本上弄清了该病毒的二维结构及增殖方式,明确了其强、弱毒在形态上无明显差异。但该病毒的三维结构又是怎样的?它是如何在细胞表面上以“出芽”方式进行增殖的?整个细胞表面将以多大数率和面积增殖病毒?整个单层细胞有多少被感染?我们通过扫描电镜技术来研究这些问题。     

贵州省部分地区山羊痘的诊断

山羊痘是由山羊痘病毒属的山羊痘病毒(goatpoxvirus,GPV)引起山羊的一种急性、热性和接触性传染病。2 0 0 3年3～4月,在贵州省2县的3个疫点相继暴发一种全身皮肤及部分黏膜(呼吸道及消化道黏膜)出现痘疹(丘疹)的传染病。皮肤痘疹最初为红斑,红斑肿胀隆起形成结节状丘疹,然后丘疹发生凝固性坏死,脱落而形成痂皮。病羊发热,眼、鼻黏液脓性分泌物显著增多。本病在同群山羊中传播迅速,可通过直接接触、呼吸道、消化道和受损伤的表皮或污染的厩舍及用具而感染,病羊水泡液和唾液含有大量病毒而成为传染源。潜伏期2～14d ,羊群一旦发病,发病率和…     

应用电镜技术对猪瘟病毒的观察

应用电子显微镜技术早期观察猪瘟病毒,由于该病毒不能在体外增殖而受到了限制,另一方面,由于感染猪本身的组织和血清被其它病原体污染也妨碍了研究,Reagan和他的同事们在感染猪血清中发现病毒粒子为22～30nm(平均为27nm),Ageev在感染该病毒猪红细胞表面上和血清中检出直径为20～44nm球形粒子,经组织培养分离猪瘟病毒的早期报告为20～80nm,但以后对生长在组织培养物上的纯化了的猪瘟病毒报告是球形的,直径为37～67nm,并带有囊膜粒子,偶尔在病毒囊膜上石到呈不规则排列的纤突。     

人工感染PRRSV仔猪肺和子宫细胞凋亡的电镜观察

应用透射电子显微镜对仔猪感染猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)后不同时期肺和子宫凋亡细胞的超微形态结构进行了观察。结果表明,PRRSV可诱导宿主肺和子宫发生典型的细胞凋亡,表现为细胞的超微形态结构随着病毒感染进程出现不同的特征性变化,早期(感染后第8 h至第3 d)凋亡细胞多表现为细胞体积缩小,细胞质密度增强,染色质浓缩,核仁解体,内质网扩张;中期(感染后第5 d至第9 d)凋亡细胞体积显著缩小,细胞膜突起,线粒体增多,有凋亡小体形成;晚期(感染后第10 d以后)凋亡细胞形态多表现为凋亡小体降解和消失,少数凋亡细胞在凋亡晚期表现为坏死细胞。肺细胞凋亡主要发生于肺巨噬细胞和肺泡上皮细胞,子宫细胞凋亡主要发生于子宫内膜细胞和内膜腺细胞。