雏鸡体内新城疫病毒强毒的荧光定量RT-PCR检测

将新城疫病毒(NDV)强毒H2株经滴鼻感染和同居感染18日龄雏鸡,应用建立的荧光定量RT-PCR检测病毒在雏鸡体内各组织的动态分布.结果显示,滴鼻感染后第6 h,即可在肺、脑、脾、肾和肠5种组织中检出NDV RNA,而12 h后所有组织均能检测到;同居感染12 h后才可在肺、脑、脾和肾4种组织中检出,而24 h后所有组织均能检测到;在上述2种感染途径中,受检组织内的病毒含量从高到低依次为:肺、脑、脾、肾、肠、肝、心脏和腿肌.与普通RT-PCR相比,检测灵敏度相近.     

病猪肺组织中PRRSV抗原免疫组织化学Envision法的原位检测

为探讨肺组织中猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原的定位诊断方法,制备了兔抗PRRSV抗体,采用免疫组织化学Envision法对疑似PRRS病猪肺组织中的病毒抗原进行了定位和半定量检测.SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,制得的兔抗PRRSV IgG纯度较高,具有良好的特异性,可用于原位检测病猪肺组织中PRRSV抗原的分布;Envision法的检测结果显示,PRRSV抗原的阳性表达产物主要出现在肺巨噬细胞胞浆内,其次为肺泡上皮细胞和细支气管黏膜上皮细胞;通过对5份经RT-PCR检测确认的PRRS病猪肺组织进行检测.均有较高的阳性细胞表达,平均阳性细胞率为46.5%.证明Envi-sion法具有高敏感、低背景、快速简便的特点,可用于肺组织中PRRSV抗原的快速检测.     

自然感染犬瘟热病毒小熊猫的病理学观察

对自然感染犬瘟热病毒的小熊猫进行了系统的病理学观察。结果表明 ,犬瘟热病毒对小熊猫内脏器官可造成广泛性损伤。在淋巴系统各器官 (淋巴结、脾等 )表现为变性、坏死、淋巴细胞减少等退行性变化 ;肺表现为浆液性 化脓性肺炎 ;胃肠道表现为卡他性炎 ;脑表现为非化脓性脑炎 ;同时在支气管上皮细胞、肺泡壁上皮细胞、食管上皮细胞、肠上皮细胞、胆囊上皮细胞、肾小管上皮细胞和膀胱上皮细胞等胞浆内出现嗜酸性包涵体。     

鸡体内鹅源新城疫病毒抗原的免疫组织化学检测

为研究鹅新城疫(ND)的发病机理,用3株鹅新城疫病毒强毒株分别人工感染25日龄雏鸡,以单克隆抗体介导的免疫组化(IHC)法检测攻毒鸡体内NDV抗原的分布及定位,研究了鹅新城疫病毒(NDV)对鸡的组织嗜性.结果显示,在试验鸡多种组织器官中均能检测到NDV抗原,病毒抗原主要定位于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞、肝细胞及各种上皮细胞的胞浆内.结果表明,鹅NDV强毒株对鸡是一种泛嗜性病毒.     

鹅细小病毒在雏鹅体内分布的免疫组织化学检测

采用间接免疫酶组织化学染色法对14日龄雏鹅人工感染鹅细小病毒后不同时间段病毒抗原在体内的定位及分布情况进行了检测,同时应用图像分析软件对免疫组织化学图像中的抗原强度进行了定量分析。结果显示,感染后第1天到第21天,在心、肺、脾、肝、法氏囊、胸腺、腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、食管12种组织器官中检测到了病毒抗原。其中感染后第5天的感染组织最广泛,抗原染色强度最高,在检测的组织中以空肠的检出率最高。病毒抗原广泛分布于肠道的上皮细胞、腺上皮细胞,肺泡壁细胞和肾小管的上皮细胞内。始终未能从大脑、胰腺和骨骼肌中检测到鹅细小病毒。可见该病毒感染雏鹅后存在于患病鹅的大部分组织器官内,进一步证实该病毒是一种泛嗜性病毒。     

动物组织胞浆菌病

动物组织胞浆菌病(Animal Histoplosmsis)主要是由荚膜组织胞浆菌(Histoplo-sma capsulotum)引起,呈现各种不同的临床症状。动物组织胞浆菌病(尤其狗和野生啮齿类动物)分布于全世界。本病呈进行性全身性感染时,多数导致死亡;局部感染常呈良性转归。荚膜组织胞浆菌嗜网状内皮系统,但机体的其它组织也可被侵害。根据在被感染组织中的寄生相菌体的确定和病原体的分离,对本病可做出确实的诊断。荚膜组织胞浆菌的感染能致发一种特久性的皮肤过敏反应,凭借这种特异性的皮肤过敏反应,用荚膜组织胞浆菌素对牛群可揭发本病的隐性感染。本病无满意的治疗方法。     

PADV3自然感染猪组织中病毒含量的实时荧光定量PCR检测

为了解猪腺病毒3型(PADV3)在自然感染猪体内不同器官组织中的分布情况,利用实时荧光定量PCR检测方法,定量检测了自然感染PADV3的仔猪、妊娠母猪以及与猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染的仔猪不同器官组织中PADV3病毒的含量。结果,在感染的猪体多种器官组织中均可检测到PADV3,但是在各器官组织中病毒的含量有差异,其中肠黏膜、肺组织、肠系膜淋巴结、扁桃体中病毒含量较高,心、肝、脾组织中病毒含量较低;在同时混合感染PCV2的仔猪肺组织、肠系膜淋巴结、扁桃体中PADV3含量显著增加。结果表明,PADV3对猪肠黏膜、肺组织、肠系膜淋巴结、扁桃体有较强的嗜性,对心、肝、脾组织的嗜性相对较弱;PCV2混合感染可促进PADV3在仔猪体内的增殖,能增强PADV3对感染器官组织的亲嗜能力。     

以间接BA染色技术进行兔病毒性出血症病原定位及其动态变化研究

本文在对兔病毒性出血症病死兔及试验感染后不同发病阶段病兔进行临床、病理以及心、肝、肾、脑、肺、淋巴组织等血凝价消长规律研究的基础上,应用生物素-亲和素-酶免疫组化技术,对于本病病原在宿主细胞内的分布及其动态变化进行了观察,详细描述了兔出血症病毒在肝、肾、脾实质细胞及血管内皮细胞胞核及胞浆内出现的时间、形态及其动态变化,并联系临床及病理变化对于本病过程中重要病理变化的发生机理进行了论述。     

鸡大肠杆菌病超微结构病理的研究

用O_1血清型大肠杆菌制备负染样品和扫描电镜样品，并对AA鸡气管接种上述大肠杆菌后24小时扑杀取心、肝、气管、肺、肠作透射电镜样品。在透射电镜和扫描电镜下，大肠杆菌呈杆状，两端略呈圆形，内膜为细胞膜。外有细胞壁，周身有较密的菌毛，两端或侧端有细而长的波浪形鞭毛，通过细胞膜附着于菌体的胞浆中。在人工感染鸡的心、肝、气管、肺、肠等组织胞浆中都能看到大肠杆菌或在自噬空泡中有降解的大肠杆菌残骸，其中以肺脏的变化较严重，细菌主要存在于肺胸膜下和肺泡壁毛细血管内皮细胞质膜下的胞浆中。     

绵羊肺腺瘤病毒内蒙古株的分离与观察

以内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺组织 4例和 3月龄绵羊胎肺 2例作为材料 ,对胎肺细胞进行了原代培养并接种绵羊肺腺瘤病毒悬液 ,进行了绵羊肺腺瘤病毒 (JSRV)的分离 ,同时采用电镜负染色技术和超薄切片透射电镜技术对上述样品进行了观察。结果表明 ,自然感染绵羊肺腺瘤病的 4例病肺组织中都有散在的病毒粒子 ,其直径为 10 0～ 12 5nm ,接种病毒悬液的胎肺细胞从第 2代到第 9代均出现细胞病变 ,但对绵羊胎肺培养的病毒悬液电镜负染色观察未发现典型的病毒粒子 ,而超薄切片透射电镜观察发现了病毒样粒子     

猪伪狂犬病病毒变异株感染绵羊胚胎鼻甲上皮细胞的病毒形态发生和细胞超微结构观察

应用超薄切片和透射电子显微镜技术,研究猪伪狂犬病病毒(PRV)MQ18变异株感染绵羊胚胎鼻甲上皮细胞(OFTu)的病毒形态发生和超微结构变化。结果显示:病毒在细胞核内复制、增殖,形成核内包涵体,装配好的病毒通过核内膜获得初始囊膜,以出芽方式出核进入细胞质,在高尔基体区域进行加工修饰、二次获得囊膜后形成完整病毒粒子,以包裹有病毒粒子的空泡与细胞膜相互融合方式,将病毒释放到细胞外;细胞超微结构主要表现为细胞质内空泡增多,线粒体增生、肿大,空泡样变,粗面内质网扩张,高尔基体形态异常,细胞核染色质浓缩、边集,最后细胞破坏、裂解,可见细胞早期凋亡及自噬小体结构。本研究结果为阐明PRV的感染和致病机制提供了理论依据。     

伪狂犬病病毒gE/gB PCR鉴别方法的建立及其应用

为了检测伪狂犬病病毒(PRV)潜伏感染及确定病毒潜伏的主要部位,建立了能鉴别PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株gE/gB的PCR诊断方法。结果表明,所建立的PCR 特异性强、敏感性高、稳定性好,能用于病毒潜伏感染的检测;同时还确定PRV潜伏感染的主要部位是三叉神经节、扁桃体、嗅球、脑干、脑桥和咽黏膜。     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ATCC VR 2332 株人工单独感染3 头3 周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR 2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2 头3 周龄仔猪,每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现,并用HerdChek IDEXX 试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀,对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明,用所获得的3 株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外,用IIF检测7 头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片,其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应;对这2头猪的肺组织进行病毒分离,在盲传到第4代时Marc 145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠,且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

猪伪狂犬病病毒JSZ株的分离鉴定及其病毒核酸的分布规律

用猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性引物对江苏省某猪场疑似猪伪狂犬病的病死仔猪组织病料进行了PCR鉴定,结果可扩增到特异性的条带.用该病料接种PK-15细胞,24 h即出现细胞病变,PCR和间接免疫荧光试验结果均证明所分离病毒为PRV.用该PRV分离株接种兔后出现奇痒症状并麻痹致死;接种仔猪后出现持续发热,肌肉震颤等症状.通过对自然感染PRV病死仔猪脏器进行PCR检测,发现PRV在仔猪体内广泛分布,其中以脾的检出率最高,可达100%;对人工感染猪的直肠和鼻腔棉拭样品进行PCR检测,发现病猪排毒最长可达13 d.证实,该分离株为猪伪狂犬病强毒株,脾为病毒检测的首选靶器官.     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株的分离鉴定

为获得1株猪伪狂犬病病毒贵州分离株,将贵阳市某猪场送检的流产胎儿病料经一系列处理后接种Vero细胞,并对分离毒株分别进行了病毒理化特性、电镜形态观察、中和试验、动物接种试验、核酸检测等鉴定。当盲传至第3代时,出现细胞变圆变亮、脱落、呈拉网状特征的细胞病变;分离毒不耐酸和热,对5-碘脱氧尿核苷和有机溶剂氯仿敏感,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;透射电镜下可见位于囊泡中呈近圆形、有囊膜、150～180 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;将分离毒株接种家兔,能引起家兔奇痒、麻痹死亡;PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

绵羊睾丸支持细胞的分离鉴定及其在山羊痘病毒疫苗株培养中的应用

为研究绵羊睾丸支持细胞对山羊痘病毒的增殖特性,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步法分离绵羊睾丸支持细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察、细胞染色鉴定以及特异性表达ABP蛋白鉴定,然后接种山羊痘病毒疫苗株。结果显示,分离的原代细胞24 h可长满单层,用0.05%的胰酶消化处理3次可得到纯度约为80%的睾丸支持细胞;油红O染色可观察到绵羊睾丸支持细胞的细胞质含有大量脂肪滴,细胞核可见双极小体;HE染色后细胞核为蓝色,细胞质呈红色或粉红色。ABP蛋白间接免疫荧光可观察到在绵羊睾丸支持细胞的细胞质和细胞核周围有绿色荧光,经显微镜下计数其纯度达80%以上。接种山羊痘病毒疫苗株后第4天有90%细胞产生病变,细胞变圆,细胞聚集成簇状,细胞收缩、细胞核出现空泡化。qPCR扩增Ct值为18.81,Ct值低于其他细胞传代数值。结论,本研究成功分离培养了绵羊睾丸支持细胞,该细胞能较好地培养山羊痘病毒疫苗株,对羊痘疫苗的生产有一定的现实意义。     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV218bp片段的RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法从BVDV标准毒株OregonC24V中扩增出了218bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、MDBK正常细胞的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10-1TCID50。不同人员用该方法进行检测,结果均一致,表明其重复性好。应用该方法对70份临床疑似发病猪样品进行检测,结果检出11份阳性,阳性检出率约为15.7%。在对5份细胞培养用犊牛血清的检测中,亦检出2份阳性。表明,建立的RT-PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的临床检测及流行病学监测。     

适合鸭瘟病毒弱毒增殖的MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立

为了建立适于鸭瘟病毒(DPV)弱毒增殖的细胞系,利用4个主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭品系,体外分离鸭胚肝细胞,在干细胞因子、白细胞抑制因子和成纤维细胞生长因子诱导下,获得鸭胚肝间充质干细胞(DuLMSC)。接种DPV疫苗株C-KCE后,结果显示:F1~F10代均能稳定出现CPE;将F10病毒接种细胞24 h后,通过扫描电镜在胞质、胞核及细胞间隙均能够观察到典型的疱疹病毒粒子;F1至F10代均能扩增出DPV UL2基因片段,序列测定结果表明F1、F5、F10代的扩增产物与NCBI中公布的DPV株(EU082088)的核苷酸同源性为100%;组织培养半数感染量和一步生长曲线结果表明,源自B4系单倍型鸭的DuLMSC细胞系增殖DPV的病毒含量明显高于B1、B2和B3系。本研究为稳定培养鸭瘟病毒提供了优良稳定的实验材料。     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。