宿主蛋白Ambra 1介导非洲猪瘟病毒MGF360-9L抑制其复制的机制

MGF360-9L是非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）重要的毒力基因,本实验室前期使用免疫共沉淀和液相色谱-质谱（IP-MS）联合技术,明确了MGF360-9L和宿主蛋白自噬/苄氯素1调节因子1(autophagy/beclin-1 regulator 1,Ambra 1)具有相互作用,现有的研究已经证实宿主蛋白Ambra 1在病原感染中发挥重要作用。为明确Ambra 1介导MGF360-9L对ASFV复制的调控作用及其机制,本研究构建Ambra 1真核表达质粒,使用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）和间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay,IFA）技术,验证了Ambra 1和MGF360-9L的互作及互作区域。设计并合成Ambra 1的RNA干扰（RNAi）序列,运用实时荧光定量PCR(real-time q PCR,RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹（Western-blot）技术,证明了Ambra 1过表达抑制ASFV的复制,下调Ambra 1的表达则能够促进AS...     

PERK基因表达干扰对绵羊痘病毒复制影响的研究

为探究干扰Hela细胞上PERK基因表达对内质网未折叠蛋白反应(UPRER)的作用及对绵羊痘病毒(sheep pox virus,SPPV)复制的影响。本研究在HEK293T细胞进行PERK短发夹RNA(shRNA)慢病毒包装并转染Hela细胞,通过实时定量RT-PCR、细胞免疫荧光和Western-blot检测PERK在mRNA和蛋白水平的表达量,同时,用内质网应激激活剂tunicamycin处理shPERK细胞株后检测PERK通路上eIF2α,P-eIF2α,ATF5和ATF4等基因的蛋白表达情况。另外,接种SPPV2于shPERK细胞株,观察干扰PERK表达对病毒复制的影响。结果,与空白对照组和阴性对照组相比,慢病毒介导的PERK shRNA成功转染了Hela细胞;与阴性对照组比较,试验组PERK在mRNA水平和蛋白水平都明显降低,且mRNA水平两者差异极显著(P0.001);用tunicamycin处理后,试验组eIF2α,P-eIF2α,ATF4和ATF5基因蛋白表达下调;PERK基因表达干扰后SPPV2的复制减弱,说明PERK在调控SPPV2的复制具有重要作用。以上结果为进一步深入探究UPRER对SPPV2复制的影响及阐明病毒与宿主相互作用的分子机制奠定基础。     

鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株M蛋白基因的变异及其B细胞表位稳定性

以陕西8株鸡传染性支气管炎病毒(AIBV)分离株M蛋白的基因序列为基础,应用DNAStar软件中的MegAlign模块对其进行了同源性分析;用Kyte-Doolittle方法、Jameson-Wolf方法、Karplus-Schulz方法、Plot-Emini方法和Garnier-Robson方法综合预测了其中4株代表毒株的M蛋白B细胞抗原表位和二级结构。结果,8株AIBV的M蛋白主要在10~40 aa和90~175 aa处存在无规律的点突变,与参考毒株H52、M41、SAIB20、LX和Gray的M蛋白的核苷酸序列和预测的氨基酸序列的同源性分别介于87.4%~99.5%和96.3%~99.5%;分离株间的核苷酸序列和预测的氨基酸序列同源性分别介于91.8%~99.8%和95.4%~100%。4株代表株的M蛋白B细胞优势抗原表位都在159~164 aa和181~193 aa肽段区(这2个区域都包含了无规则卷曲和β-转角结构)或其附近。结果表明,AIBV分离株的M蛋白基因相对保守,只存在无规律的点突变,该变异对AIBV M蛋白B细胞表位的稳定性无影响。     

宿主Arf6通过阻止口蹄疫病毒入侵发挥抗病毒作用

本实验室前期i TRAQ技术研究发现母猪初乳中Arf6表达量显著高于常乳,现有文献报道Arf6在病原感染中扮演重要角色。为研究宿主Arf6在口蹄疫病毒(FMDV)感染中的作用,本研究构建Arf6真核表达质粒,应用Arf6抑制剂,利用RT-qPCR和Western-blot技术检测FMDV和Arf6的相互调控作用;构建Arf6系列突变体,评估Arf6调控FMDV复制的功能区或者功能位点;利用间接免疫荧光技术(IFA)分析Arf6对FMDV入侵的影响。结果表明,FMDV感染PK-15细胞后,内源性Arf6表达水平显著上调;过表达Arf6抑制FMDV在PK-15细胞中的复制;抑制Arf6能促进FMDV复制;Arf6(155-176 aa)不是Arf6抑制FMDV侵入的关键区域,第48位氨基酸是Arf6抑制FMDV入侵的关键位点。IFA结果显示,Arf6在细胞膜水平阻止了FMDV的入侵。结果表明,宿主Arf6在FMDV入侵层面发挥了抗病毒作用,本研究结果为揭示FMDV和宿主蛋白相互调控作用提供了理论依据。     

CVN重组蛋白体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究

本研究以Gen Bank中蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)基因序列(DQ668406.1)为基础,合成CVN基因,构建表达质粒pMAL-c5x-CVN,通过优化诱导条件,表达出可溶性CVN重组蛋白。利用cck8试剂盒检测CVN重组蛋白对Marc-145细胞的毒性,并在安全浓度范围内进行了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)试验。在PRRSV感染Marc-145细胞的吸附、穿入和复制三个阶段进行检测,探究CVN体外抗PRRSV的作用效果。各阶段的病毒TCID_(50)检测、间接免疫荧光试验以及qPCR测定结果表明,CVN在PRRSV感染宿主细胞过程中的入侵阶段发挥阻断作用,而在病毒吸附细胞和在细胞内复制的阶段没有抑制效果。本研究为新型抗PRRSV药物的研发奠定了试验基础。     

HSP27慢病毒载体的构建及其稳定表达细胞株的建立

热休克蛋白27(HSP27)是一种结构上高度保守的小分子热休克应激蛋白,它可通过与细胞自噬、细胞凋亡和天然免疫信号通路关键因子相互结合参与多种病毒的感染过程。为了便于深入研究HSP27在机体抗感染免疫中的作用,用PCR方法从A549细胞中扩增出HSP27片段,然后经双酶切、连接、转化等步骤获得HSP27的慢病毒表达载体pTRIP-HSP27,将此载体和另一对照载体pTRIP-EGFP分别转染至HEK-293T细胞中,48 h后收集慢病毒将其转导至A549细胞,经嘌呤霉素筛选获得过表达HSP27的细胞株A549-HSP27和过表达EGFP的对照细胞株A549-EGFP。最后,经RT-qPCR、Western-blottin、gIFA和细胞活力检测等方法进行鉴定,获得了能稳定表达HSP27的细胞株。     

ASFV毒力蛋白MGF360-9L降解宿主蛋白MATR3促进病毒复制的研究

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染所引起的一种高度致死的传染性疾病。ASFV多基因家族编码的MGF360-9L已被证实是ASFV重要的毒力蛋白,是ASFV逃逸宿主天然免疫应答的关键之一。本实验室的前期研究基础表明,宿主细胞核基质蛋白3(Matrin 3,MATR3)可能是MGF360-9L的相互作用蛋白之一,但这种相互作用未经验证。此外,MGF360-9L和MATR3之间是否存在相互调控,对于病毒复制或宿主免疫有何意义尚不可知。因此,本研究首先通过免疫共沉淀（Co-immunprecipitation,Co-IP）验证MGF360-9L与MATR3的相互作用;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹（Western-blot）分析ASFV野生型病毒株（ASFV-WT）、ASFV MGF360-9L缺失毒株（ASFV-ΔMGF360-9L）感染或MGF360-9L过表达对MATR3表达的影响;通过RT-qPCR、Western-blot以及分析ASFV荧光重组毒株复制...     

HSP27在黄体期牦牛主要生殖器官中表达差异的研究

为了探讨正常生理条件下牦牛热休克蛋白27(HSP27)在黄体期牦牛主要生殖器官中的表达差异,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测了HSP27基因在黄体期牦牛卵巢、输卵管和子宫中的相对表达量,用Western-blot和免疫组织化学SP法研究了HSP27蛋白在黄体期牦牛卵巢、输卵管和子宫中的表达量和组织内分布。RT-qPCR分析表明,HSP27基因在黄体期牦牛卵巢、输卵管和子宫中均有表达,其中卵巢中的表达量分别是输卵管和子宫组织的1.03倍和4.63倍。免疫组织化学结果表明,牦牛卵泡膜内层、颗粒层、输卵管黏膜上皮、子宫内膜上皮和子宫腺中均有HSP27阳性表达。Western-blot和免疫组织化学结果表明,HSP27蛋白在黄体期牦牛各主要生殖器官组织中表达差异极显著(P0.01),其中在卵巢中表达量最高,在子宫中表达量最低。本试验结果表明,HSP27在黄体期牦牛的各个主要生殖器官中存在表达差异,这为进一步研究HSP27在哺乳动物生殖过程中发挥的作用提供了理论依据。     

大肠埃希氏菌表达FMDV 3AB非结构蛋白的纯化复性与活性检测

采用超声波裂解细菌 ,高浓度尿素裂解包涵体和金属螯合亲合层析的方法对大肠埃希氏菌中表达的FMDV 3AB非结构蛋白进行纯化 ,经SDS PAGE分析 ,3AB融合蛋白纯度达 90 %以上。采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对融合蛋白进行复性 ,通过Westernblotting分析 ,表明复性后的 3AB融合蛋白能与抗FMDV抗体发生特异性结合。ELISA检测表明 ,复性后的 3AB融合蛋白有很好的抗原活性。     

山羊痘病毒L1蛋白的原核表达及其功能分析

为了探究山羊痘病毒L1蛋白在病毒感染Vero细胞过程中的作用,将山羊痘病毒L1蛋白基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物。表达的目的蛋白经镍亲和柱纯化后免疫家兔制备了抗血清,通过蛋白封闭试验和血清抑制试验研究了纯化蛋白及其抗血清对山羊痘病毒感染的抑制作用。结果显示,成功表达了山羊痘病毒的L1蛋白,表达产物为48ku左右的重组蛋白,它能被山羊抗山羊痘病毒阳性血清识别。加入L1蛋白封闭,可使山羊痘病毒感染细胞的病变时间推迟12h,病毒与L1蛋白抗血清作用后效价下降了87.8%。结果表明,L1蛋白可能是山羊痘病毒的受体结合蛋白,并能在病毒侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。     

LncRNA TCONS_00179042对Marc-145细胞中PRRSV复制的影响

应用转染Lnc RNA TCONS_00179042过表达质粒pc DNA3.1-TCONS_00179042的Marc-145细胞,观察该Lnc RNA对PRRSV GSWW15毒株复制的影响。利用RT-PCR方法扩增出猪肺泡巨噬细胞(PAMs)被PRRSV GSWW15株感染后下调表达的Lnc RNA TCONS_00179042全长序列;通过q PCR、TCID50测定和Westernblot分析该Lnc RNA对PRRSV GSWW15株复制的影响;通过核质分离试验对PAMs细胞中Lnc RNA TCONS_00179042进行定位和半定量分析。RT-PCR检测结果显示,Lnc RNA TCONS_00179042长度约为430 bp。pc DNA3.1-TCONS_00179042过表达载体转染Marc-145细胞后,q PCR结果显示:该Lnc RNA的相对表达量约是对照组的3×105倍,表明Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中过表达。利用PRRSV GSWW15株感染过表达Lnc RNA TCONS_00179042的Marc-145细胞后,q PCR结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV RNA拷贝数约为对照组的60%;TCID50检测结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV病毒滴度显著低于对照组,约为对照组的20%;Western-blot试验结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV N蛋白的表达量显著低于对照组。三组数据均显示,Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中抑制PRRSV GSWW15株的复制。核质分离试验结果显示,不论是细胞质还是细胞核均有Lnc RNA TCONS_00179042存在,且细胞核中的表达量大于细胞质中。本研究结果表明,该Lnc RNA能在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制,能作为一种抗病毒分子参与调控宿主的抗病毒反应。     

猪Hsp40基因过表达与干扰重组慢病毒载体的构建

热休克蛋白40(Hsp40)作为Hsp70蛋白的分子伴侣,在病毒生命周期中扮演重要角色,笔者拟通过慢病毒感染技术分别建立Hsp40基因过表达和沉默的猪肺泡巨噬细胞系,为以后开展猪Hsp40蛋白调控猪圆环病毒2型(PCV2)复制的机制研究提供有效模型。提取猪肺泡巨噬细胞(PAM)的总RNA,反转录成cDNA后用于Hsp40基因编码区的扩增,并将其克隆到慢病毒过表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro。测序正确后,设计针对Hsp40基因的4条shRNA干扰序列和1条阴性对照序列,并将其分别插入到慢病毒干扰载体pCDH-U6-MCS-EF1-GreenPuro。将上述6个载体分别与3个辅助载体pVSV-G、pRev和p Gag/Pol共转染293T细胞进行病毒包装,测定其滴度后用于感染PAM细胞,采用RT-qPCR和Westernblot方法对Hsp40的表达效果进行鉴定。猪Hsp40基因过表达和沉默重组慢病毒的获得为进一步研究Hsp40蛋白对PCV2复制的影响和机制奠定了基础。     

LncRNA9606对猪流行性腹泻病毒复制的影响

长链非编码RNA(lncRNA)是一种长度大于200 nt的非编码RNA分子,在调节多种生命活动中起着重要作用。本团队前期研究发现,宿主的lncRNA表达谱在猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染后发生显著变化。本研究选择其中一条差异表达的LncRNA TCONS_00009606(LncRNA9606),以研究它对PEDV复制的影响。为此,本研究首先检测LncRNA9606在PEDV感染后不同时间点的动态表达变化。结果,PEDV感染显著上调LncRNA9606的表达。随后对猪肠上皮细胞、派伊尔氏淋巴集合结以及外周血单个核细胞中LncRNA9606的表达丰度进行了分析,结果显示派伊尔氏淋巴集合结和外周血单个核细胞中的LncRNA9606含量显著高于小肠上皮细胞系细胞,并主要定位于细胞核中。在LLC-PK1细胞中过表达LncRNA9606后,PEDV复制水平显著降低。由此可见,LncRNA9606可在LLC-PK1细胞中抑制PEDV病毒的复制。     

利用杆状病毒表达系统表达猪IFN-L3及其抗PEDV活性的研究

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞上表达重组猪干扰素L3(rPoIFN-L3)进行抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的研究。首先通过间接免疫荧光和Western-blot验证rPoIFN-L3表达,并用Protein A亲和层析柱进行蛋白纯化;采用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(VSV~*GFP)检测rPoIFN-L3的抗病毒活性,含rPoIFN-L3的细胞上清的抗病毒活性为1×10~3AU/mL,纯化的rPoIFN-L3抗病毒活性为5×10~5AU/mg。进一步对纯化的rPoIFN-L3蛋白在IPEC-J2细胞上进行抗PEDV活性探究,结果显示,rPoIFN-L3可呈剂量依赖性抑制PEDV复制,并且上调相关干扰素-刺激基因(ISGs)的表达。由此证明,本研究表达的rPoIFN-L3具有抗病毒活性,并可有效抑制PEDV在IPEC-J2上的复制,对预防和治疗PEDV感染有重要意义。     

柔嫩艾美耳球虫穿孔素样蛋白基因的原核表达与亚细胞定位

为了研究柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)穿孔素样蛋白(Et PLP)在球虫感染中与宿主相互作用关系,首次成功获得EtPLP1(1 932 bp)和EtPLP2(4 215 bp)2个目的基因。通过表达纯化得到2个大小分别为37和67ku的目的蛋白,Western-blot结果显示其反应原性良好。通过免疫荧光技术,观察到EtPLP1定位在子孢子顶端。m RNA转录水平检测结果显示,EtPLP1在子孢子阶段的表达量最高,其次是第1代裂殖子阶段,EtPLP2m RNA水平在第1代裂殖子阶段表达量最高,其次是第2代裂殖子阶段;它们在其他阶段表达量极低或不表达。结果表明EtPLP1和EtPLP2可能参与虫体入侵与逸出宿主细胞,为EtPLPs蛋白功能研究奠定了基础。     

杆状病毒GP64蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为研究杆状病毒GP64蛋白在感染宿主过程中的表达情况,通过克隆构建含GP64基因的重组质粒,在CHO-S细胞表达重组GP64蛋白,利用野生型杆状病毒免疫BALB/c小鼠血清,筛选出重组GP64蛋白的单克隆抗体。结果表明,构建出正确的GP64重组质粒,成功表达出GP64蛋白,筛选出1株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞5B1;单克隆抗体亚类鉴定结果显示,单抗亚类为Ig G2b,轻链类型为κappa;IFA和Western-blot结果显示筛选出的GP64单克隆抗体可以与杆状病毒及GP64蛋白发生特异性结合。结论,GP64蛋白的单克隆抗体制备成功。     

与猪圆环病毒2型基因组茎环结构相互作用的宿主细胞蛋白的筛选

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库,将总cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化酵母诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建,以药物筛选阳性克隆;通过酵母菌落PCR得到阳性克隆中的cDNA插入片段,通过序列分析对此予以确认。本试验成功地构建了酵母单杂交文库,筛选出1.01×106个酵母克隆,其中196个为阳性克隆。经PCR产物测序,并通过NCBI Blast法进行序列比对,确定有4种蛋白可与PCV2基因组茎环序列发生作用。本研究从宿主细胞cDNA文库中筛选到4种可与PCV2基因组茎环序列发生作用的蛋白,为下一步阐明这些宿主蛋白对PCV2复制的调节作用奠定了基础。     

野鸭源新城疫病毒V蛋白抑制宿主细胞干扰素β产生的机制研究

为研究野鸭源新城疫病毒(ND V)V蛋白抑制宿主细胞干扰素β(IFN-β)产生的机制,构建真核表达新城疫病毒强、弱毒株V蛋白的重组载体,分别与IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/Ⅰ-Luc、AP-1-Luc报告质粒共转染H EK-293T细胞,接种仙台病毒刺激宿主细胞后,测定宿主细胞的相对荧光素酶活性。结果显示,新城疫病毒强毒株V蛋白(vNDV-V)能抑制NF-κB、AP-1、PRDⅢ/Ⅰ启动子活性,新城疫病毒弱毒株V蛋白(aNDV-V)能抑制NF-κB、AP-1启动子活性,进而抑制IFN-β的产生。构建新城疫强弱病毒V蛋白嵌合体进行试验,结果表明NDV强毒株V蛋白羧基端在抑制PRDⅢ/Ⅰ启动子活性中发挥关键作用。研究结果为深入研究V蛋白对抗宿主细胞天然免疫机制奠定了基础。     

细胞自噬相关蛋白ATG9A对口蹄疫病毒侵入的影响

为揭示细胞自噬相关蛋白9A(ATG9A)对口蹄疫病毒（FMDV）复制的影响,利用IFA、RT-qPCR和Western-blot等方法检测FMDV与ATG9A的共定位情况以及病毒感染对ATG9A的影响;通过构建ATG9A重组表达质粒和合成小干扰RNA,检测过表达及敲降ATG9A对FMDV吸附、内化、基因组复制、蛋白翻译、子代病毒粒子产生的影响。结果显示,FMDV感染后与ATG9A共定位且抑制ATG9A的表达;ATG9A不影响FMDV的吸附,但极显著地抑制FMDV的内化过程;同时,过表达（或干扰）ATG9A能够在RNA与蛋白水平显著降低（或提高）FMDV的增殖和子代病毒粒子产生的能力。结论,ATG9A抑制FMDV的复制,为深入认识FMDV在细胞内的复制周期提供了线索。     

牛病毒性腹泻病毒P20及P14蛋白基因的表达及其产物的抗原性分析

将牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)p20和p14基因分别亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX-HTb,并转化至相应的宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和DH5α中表达。P20蛋白在2个宿主中都获得了高效表达;P14蛋白在BL21(DE3)pLysS中表达量较低,而在DH5α中未见表达。对P14蛋白诱导表达过程的监测表明,P14蛋白对大肠杆菌是一种毒性蛋白。用Western-blotting分析未能检测到两种蛋白的反应条带,推测这两种蛋白可能存在构象表位。