布氏锥虫伊氏亚种的体外克隆

应用改良的Baltz无细胞培养系统,参照Hirumi以饲养层培养 系统克隆锥虫的方法,建立了布氏锥虫伊氏亚种的体外克隆方法。对3个 虫株进行克隆,被检虫悬液液滴42.5％～47.5％只含1条锥虫;克隆培养的成功率JG株为67.7％,YN株为78.％,CVCC614株为70.6％。     

伊氏锥虫体外培养的研究

用鼠体继代的水牛伊氏锥虫进行体外培养。经试验证实,以RPMI_(1640)加入20mmolHEPES、2mmol L-谷氨酰胺、2mmol L-苏氨酸、1.5mg/mlD-葡萄糖、0.5％水解乳蛋白(LH)及10％灭活犊牛血清组成的CM_3培养基,并以牛睾丸原代细胞为饲养层细胞效果最好,在37℃下可较好地支持伊氏锥虫的生长,接种虫体起始浓度为10~5/ml左右,可于第2天增至10~6/ml,并可维持该浓度达5天之久,从第6天开始,虫体逐渐减少,虫体可在该系统中存活14天,将培养12天的培养物接种小鼠,对小鼠致病性不变,同时还测定了HEPES、D-葡萄糖、培养不同时间的细胞单层、虫体不同接种浓度等对锥虫体外培养的影响。     

布氏锥虫伊氏亚种体外药敏试验

应用布氏锥虫伊氏亚种(Trypanosoma brucei evansi,T.b.e)体外药敏试验系统检查了国内6个T.b.e虫株和国外布氏锥虫指名亚种(T.b.b)对苏拉灭(Suramin)、贝尼尔(Berenil)、安锥赛(Antrycide)、咪唑苯脲(Imidocard)和硫胂聚氰胺(Cymelarsan)等5种抗锥虫药的敏感性。结果表明,该系统能准确测定不同虫株对各种药物的敏感性,与小鼠治疗试验结果基本相符,发现了国内抗贝尼尔和苏拉灭的T.b.e虫株。     

布氏锥虫伊氏亚种体外培养的研究——用小鼠腹腔巨噬细胞作滋养层培养布氏锥虫伊氏亚种

用小鼠腹腔巨噬细胞作滋养层,以HEPES缓冲的添加20％兔或马血清、0.1％葡萄糖、0.2mmol 2-巯基乙醇、2mmol丙酮酸钠、0.1mmol次黄嘌呤(用马血清时)、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml)的含MEM非必需氨基酸的MEM培养液体外培养布氏锥虫伊氏亚种获得成功。连续培养60天,培养虫体绝大多数仍保持细长形态,并对小鼠有很高感染性。文内还就实验方法和结果结合文献对一些问题作了讨论。     

分泌抗布氏锥虫群共同抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用DEAE-纤维素分离的布氏锥虫伊氏亚种JG克隆株虫体按Segura 氏法制备抗原,常规免疫BALB/c鼠、融合、筛选和克隆。筛选时除使用免疫抗原外,还使用按同法制备的我国不同地区分离的3株布氏锥虫伊氏亚种(JX、ZJ、GY株),1个布氏锥虫马媾疫亚种虫株和培养的1株布氏锥虫指名亚种发育前期型虫体的抗原,以及泰氏锥虫和弓形虫抗原。共获得8个杂交瘤细胞株(4A_(11)、2D_6、5C_8、2E_3、1H_8、1C_9、1F_(11)、4F_6。它们分泌的单克隆抗体与泰氏锥虫、弓形虫抗原均无反应。4A_(11)、2D_6在ELISA和间接免疫荧光试验中只与免疫克隆株抗原反应。其余6株在ELISA中不仅与免疫株抗原反应,而且与其他锥虫虫株抗原呈明显交叉反应,免疫荧光试验则全部阴性。在ID试验中,1C_9、1F_(11)腹水与上述6种抗原呈现明显沉淀线,另6株则均无反应。4A_(11)和2D_6是针对伊氏锥虫群JG克隆株特异抗原,而5C_8、2E_3、1H_8、1C_9、1F_(11)、4F_6则是抗布氏锥虫群共同抗原。     

钴~(60)γ射线照射伊氏锥虫免疫试验

家畜伊氏锥虫病广泛流行于我国南方,在湖北省相当严重。1973年宜城等6个县锥虫病大爆发,患病牛、马达8241头,死亡5288头,经济损失约211万元。为控制本病流行,除用药物治疗外,并以免疫方面进行了研究。1975年Fregene等以~(137)CS照射布氏锥虫与冈保锥虫,布氏锥虫照射剂量为4.60±0.12仟拉得,冈保锥虫为2.9仟拉得,10～20天以后以10~4同源虫株攻击,前者保护存活为74.3％,后者为31.7％。但伊氏锥虫免疫效果如何,未见报道。为此,我们进行锥虫免疫试验研究。     

以单克隆抗体检测伊氏锥虫可溶性抗原的研究

通过单抗和多抗的不同组合,以夹心ELISA法检测伊氏锥虫可溶性抗原,发现混合单抗法敏感性最高,可检出最低抗原浓度达0.04～0.02μg/ml,比通过免疫动物制得的多克隆高免血清提高1～2个稀释度。     

分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体杂交瘤株的建立

本试验以DEAE纤维柱层析法从感染小鼠血液中分离得纯净锥虫,再通过超声乳化,制备锥虫可溶性抗原,用其免疫BALB/c小鼠,再以此BALB/c小鼠脾细胞与SP_2/o骨髓瘤细胞融合,采用Dot-ELISA和间接ELISA法筛选出7株分泌针对伊氏锥虫的单克隆抗体的杂交瘤株(IH_(10)、AE_7、EB_6、BE_5、AG_(11)、BA_5、GB_6),实验结果表明,间接ELISA和Dot-ELISA符合率良好。分泌的7种克隆抗体有5株属于IgG_1,2株属于IgG_(2a);用阴性血清封闭试验及交互抑制试验证实7株单抗都是针对伊氏锥虫的,并证明是针对不同决定簇的。     

伊氏锥虫 布氏锥虫和马媾疫锥虫对锥46的药敏试验

在我国,伊氏锥虫病流行 极广,达二十多个省区,对畜牧业生产危害极大。长期以来,伊氏锥虫病的治疗主要依赖为数甚少的几种药物,导致抗药虫株的产生,从而给该病的防治带来新的困难(沈杰等,1991;方元等,1992),急待高效新药产生。为了解决这一问题,上海家畜寄生虫病研究所与上海医药工业研究院合作,成功地合成、筛选了一种抗锥虫新药——雄46(T46)。确定伊氏锥虫对其的药敏性,为锥46的临床应用奠定合理的用药理论基础是十分必要的。本试验通过体内(小鼠治疗)和体外(人工培养)的方法检测了伊氏锥虫布氏锥虫和马媾疫锥虫对锥46的敏感性。     

中国家畜伊氏锥虫主要流行株对安锥赛的抗药性检测

用生长繁殖抑制试验测定伊氏锥虫AHB、GDB1、GDB2、GDH、GXM、HBM、HNB、JSB1、JSB2、XJCA、YNB和ZJB株的IC50值分别是0.016400、0.066940、0.022500、0.053500、0.007390、0.008436、0.037600、0.016200、0.05906、0.001511和0.012460 μg/mL.为检验生长繁殖抑制试验的准确性,用XJCA、HBM、ZJS和JSB1株腹腔接种小白鼠,用安锥赛5.0 mg/kg剂量治疗,治愈率分别为100%、100%、90%和60%.表明生长繁殖抑制试验结果与小白鼠治疗试验结果呈正相关,同时表明XJCA、GXM和HBM株对安锥赛没有抗药性,而ZJB、JSB1、AHB、GDB2、YNB、HNB、GDH、JSB2和GDB1株对安锥赛己有不同程度的抗药性,提示这些虫株分布地区治疗家畜伊氏锥虫病应适当增加安锥赛的剂量.     

唾传锥虫脊椎动物型的体外培养

(一)研究历史 唾传锥虫体外培养技术的发展可分为三个阶段。从1903年Novy和MacNeal首次培养布氏锥虫指名亚种(Trypanosomabru-cei brucei,T.b)至1976年,为第一阶段;此期间只能培养T.b和刚果锥虫(T.con-golense,T.con)无感染性的前循环型。1977～1985年为第二阶段。1977年Hirumi等以有哺乳动物细胞滋养层的培养系统培养T.b.脊椎动物型取得成功,这一突破是唾传锥虫体外培养进入迅速发     

伊氏锥虫动基体DNA微环的克隆

把伊氏锥虫云南株动基体DNA微环重组于puc19质粒载体,转化入大肠杆菌JM103菌株,获得KDNA全微环克隆。用α-~(32)P-dATP经缺口翻译标记的重组质粒(PTK)能与伊氏锥虫及其KDNA杂交,而不与核DNA杂交。该质粒探针具有高度的敏感性,能检测出10pg的KDNA和100个锥虫体,是快速鉴定伊氏锥虫的理想工具。     

泰氏锥虫体外药物筛选的研究

通过体外培养技术大量繁殖泰氏锥虫,选用抗原虫药拜尔205、贝尼尔和咪唑苯脲,抗生素青、链霉素和两性霉素B分别以不同浓度作用培养虫体,观察不同药物对虫体的杀伤和抑制作用。试验结果表明,两性霉素B对泰氏锥虫杀伤作用最强,当营养液内最终浓度为2.5ug/ml时,对虫体即表现极强的杀伤和抑制作用,最终浓度增加到25ug/ml时,则可杀死全部虫体。其次为咪唑苯脲,当营养液内最终浓度为1OOug/ml时,对虫体呈现很强的杀伤和抑制作用,最终浓度增加到1000ug/ml时,则可杀灭所有虫体。两性霉素B和咪唑苯脲对细胞均无毒害作用。青、链霉素最终浓度在250单位/ml或以下时,对虫体和细胞均无抑制和损伤作用,可作为泰氏锥虫体外培养时良好的抗杂菌污染剂。贝尼尔对泰氏锥虫有轻度的抑制作用,拜尔205对培养泰氏锥虫无损伤作用,两者对培养细胞均呈现明显的毒害作用。两性霉素B和咪唑苯脲对人工感染小鼠的伊氏锥虫无抑制和杀伤作用。     

环形泰勒虫喀什株感染牛淋巴细胞系的建立及其生物学特征的鉴定

建立1株环形泰勒虫(Theileria annulata)感染的牛淋巴细胞系,分析其生物学特征,为环形泰勒虫病疫苗研发提供新的细胞系。用环形泰勒虫喀什株感染的小亚璃眼蜱成蜱叮咬健康黄牛,当动物体温升高,体表淋巴结肿大时,用显微镜检查肩前和股前淋巴结穿刺物涂片,出现裂殖体感染的淋巴细胞时,手术摘取淋巴结,无菌条件下进行淋巴细胞的分离培养;选择合适的培养条件对该细胞进行适应性传代培养,可稳定传代培养后,绘制细胞生长曲线,测定细胞倍增时间和细胞周期,测定细胞系环形泰勒虫18S rRNA基因序列,通过序列比对分析其亲缘关系。结果显示,建立了1株可传代培养的环形泰勒虫喀什株裂殖体感染的淋巴细胞系(TaKashi),接种5.0×10~5 mL~(-1)的细胞,经72 h培养周期,细胞浓度可达到(2.8～3.0)×10~6mL~(-1),细胞存活率维持在90%以上;细胞群体倍增时间为33.4 h。细胞周期分析显示,G1期占46.2%,G2期占10.4%,S1期占43.4%,TaKashi传50代后仍然保持着淋巴细胞的形态学特征。18S rRNA基因序列比对及抗原基因Tams1同源性分析显示,该虫株与我国不同省份流行的环形泰勒虫虫株的相似性在91.9%以上,并处于同一个分支。     

应用超薄层平板聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分析伊氏锥虫可溶性抗原的初步研究

将广西骡株伊氏锥虫通过生物增殖，ＤＥＡＥ纯化，反复冻融，１００００ｒ／ｍｉｎ离心３０分钟，得到伊氏锥虫可溶性抗原（ＳＡｇ），在１０℃，１５００Ｖ，３ＯｍＡ，２５Ｗ的条件下进行起薄层聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，考马斯亮蓝Ｒ２５０染色，结果出现１８条蛋白带。各自的等电点为４．６２、４．８２、４．９６、５．０３、５．１０、５．１３、５．２２、５．３２、５．４４、５．５１、５．６５、５．７２、５．９６、６．０２、６．０９、６．３０、６．５６、７．３。各条蛋白带的绝对含量为０．０２、０．０４、０．０２、０．０４、０．７１、０．０２、０．８０、０．４２、６．００、１０．５４、９．９７、７．９２、１１．８４、１５．１８、９．７８、３．４３、３．０６、３．１８μｇ。等电点在５．４４～６．０９之间的蛋白分子是伊氏锥虫可溶性抗原的主体。     

绵羊睾丸原代细胞培养及接种羊痘弱毒后的病变观察

研究了在相同培养条件下不同培养液、不同血清和不同细胞密度对绵羊睾丸细胞生长的影响 ,并对该细胞接种羊痘弱毒后的病变情况进行了观察。结果 ,3种培养液对绵羊睾丸细胞生长的支持作用表现为MEM液 >199液 >乳汉液 ,但差异不显著 ;用犊牛血清的最适细胞密度为8.0× 10 5～ 1.0× 10 6 /mL ,用成年牛血清的最适细胞密度为 1.0× 10 6 /mL ,用绵羊血清的最适细胞密度为 8.0× 10 5/mL ;原代培养生长良好的细胞接种羊痘弱毒后出现了明显的细胞病变     

微量补体结合试验诊断边虫感染牛的研究

利用边缘边虫DS—1株接种除脾易感牛,制备出补体结合试验诊断抗原,并建立了边虫感染牛总量为0.2ml的微量补反诊断法。所制备的抗原具有良好的特异性和敏感性,对实验室条件下人工感染牛的补反检查,符合率为100％;自然条件下感染牛补反检查的符合率为92.3％;安全区牛无假阳性反应。人工感染牛于第10天可测出补反抗体,30～40天抗体滴度达到高峰,60天后开始下降。边虫补反抗原与瑟氏泰勒虫、双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、伊氏锥虫、肝片吸虫、日本裂体吸虫感染牛血清无交叉反应,与正常红细胞免疫牛血清反应为阴性结果。     

猪流行性腹泻病毒细胞适应毒LJB-03株在三种Vero细胞上增殖效果的比较

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)细胞适应毒LJB-03株在3种Vero细胞上的增殖特性,分别以正常Vero细胞、适应无血清培养基的Vero细胞和稳定表达跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)的Vero/TMPRSS2细胞(繁殖PEDV时无须添加胰酶)为宿主细胞,繁殖PEDV LJB-03株,观察这3种细胞接毒后的病变特点和病变时间,利用空斑法比较其增殖特性,并以间接免疫荧光和电镜技术鉴定病毒的增殖。结果表明,PEDV LJB-03株在正常Vero细胞和适应无血清培养基的Vero细胞上增殖时需添加的胰酶最佳质量浓度为7ug/m L;在这3种细胞上增殖时的最佳感染复数均为0.01;PEDV LJB-03株在3种细胞上效价达到峰值的时间均为36 h,其中在正常Vero细胞上病毒效价最高为7.17×10~7PFU/m L,在Vero/TMPRSS2细胞上病毒效价为3.33×10~7PFU/m L,在无血清Vero细胞上的病毒效价为2.85×10~7PFU/m L。综上所述,正常Vero细胞上PEDV LJB-03株的病毒效价可达其他2种细胞的2倍以上,但在培养病毒时正常Vero细胞需添加胰酶和血清,因此,适应无血清培养基的Vero细胞与Vero/TMPRSS2细胞在培养PEDV LJB-03株时更具有潜力。     

猪流行性腹泻病毒Vero细胞微载体培养条件的优化试验

通过研究搅拌速度、pH值、血清浓度等环境条件对细胞贴壁的影响以及细胞接种密度、微载体浓度与细胞生长的关系 ,对应用微载体技术和生物反应器系统生产猪流行性腹泻病毒(PEDV )的可行性进行了探讨。结果表明 ,搅拌转速、pH值、血清浓度均对Vero(PEDV )细胞在CT 3微载体上的贴壁率和均匀分布有影响 ;当接种密度为 15 .0× 10 4 /mL时 ,即每 1mg微载体接种 5 .0× 10 4 细胞时 ,可以获得较高的细胞密度 ;随着微载体浓度的提高 ,最高细胞密度也增加 ;在CelliGen反应器中 ,采用优化的培养条件 ,细胞密度可达到 174 .0× 10 4 /mL ,是方瓶培养的 3.5倍 ,每个细胞的PEDV含量与方瓶培养相当 ,制备的疫苗免疫原性好     

弓形体滋养体在传代细胞上的适应性及其增殖能力

弓形体是一种负于细胞内的寄生虫,除了无核细胞外,它有广泛宿主细胞的易感性。为了研究动物弓形体病的需要,我们于1978年用PTPM和RTPM两个虫株对BHK_(-21)、PK_(-15)、IB-RS-2和Vero四种传代细胞做了适应性及其增殖性的观察,并对病原性进行了探讨,回顾了弓形体体外培养的历史资料,以资共同工作着的参考和评价其结果为:弓形体进入细胞3小时后就已开始进行二分裂,6小时钻入细胞的能力基本结束;两个虫株都能适应上述四种传代细胞,在72小时内可增殖大量的虫体,收集抗原;实验证明这两个虫株都是强毒株,细胞培养66天19代不失其病原性。