非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

马麝朊蛋白基因的克隆与原核表达

为了解马麝朊蛋白基因的结构特征和其细胞型朊蛋白的性质,应用分子克隆和DNA重组技术进行了马麝朊蛋白基因的克隆、序列分析及其原核表达.序列分析表明,马麝朊蛋白基因编码区是包含在单一外显子内的完整开放阅读框,全长为771 bp,与马鹿、白尾鹿以及乳牛和绵羊朊蛋白基因相比,核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分别为97.3%～98.1%和97.7%～98.8%,说明朊蛋白基因在同科和不同科的反刍动物间是保守的;成功构建了马麝重组朊蛋白(85～233 aa)原核表达栽体pGEX-MuPrP(85～233),并转化E.coli BL21(DE3),获得重组表达菌E.coli GST-MuPrP(85～233),该重组菌可产生预期大小约为42.4ku的融合蛋白GST-MuPrP(85～233),在优化表达条件下,可产生占细菌总蛋白量30%以上的融合蛋白,免疫印迹检测显示表达蛋白可与抗牛单克隆抗体4C11反应,表明该基因的各氨基酸突变并未影响其单抗4C11的识别表位.     

麋鹿朊蛋白全基因的克隆及序列分析

为获得中国麋鹿朊蛋白(PRNP)的全基因,并利用DNAStar软件与已报道的其他动物的朊蛋白全基因序列进行同源性分析,根据GenBank中马鹿朊蛋白基因序列设计特异性引物,采用PCR方法从提取的总基因组中扩增得到麋鹿PRNP基因;将其连接到pGEM-T Easy载体中,获得克隆产物并测序。结果,成功扩增出了中国麋鹿PRNP基因,构建了重组质粒pGEM-T-ML;对克隆产物的序列分析表明,麋鹿PRNP基因的开放阅读框包含771bp,编码256个氨基酸的前体蛋白,前体蛋白的分子质量约为28 200u;与已报道的其他鹿科动物朊蛋白全基因的核苷酸及氨基酸序列的同源性均在98.8%以上,与几种非鹿科动物的同源性在96.5%～98.4%之间。结果表明,麋鹿PRNP基因的核苷酸和编码蛋白的氨基酸序列与其他鹿科动物的序列具有高度保守性,而与几种非鹿科动物间的同源性也较高,说明朊蛋白是一种古老的高度保守的蛋白。     

双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白(PrP)基因,并克隆到pMD 18-T载体。序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同。4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽(九肽)重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸(除LT200302为23个氨基酸外)的C-端信号肽。4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%~100.0%和94.2%~100.0%。共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变。     

猪源鹦鹉热衣原体外膜主蛋白编码基因的克隆和序列测定

运用PCR技术扩增3株猪源鹦鹉热衣原体的外膜主蛋白(MOMP)编码基因,将扩增产物连接到pMD 18-T载体克隆,经酶切鉴定、PCR鉴定并分析其序列,3菌株的MOMP核苷酸序列的同源性为98.4%～99.0%,氨基酸序列的同源性为97.5%～98.1%,他们之间的差异很小,属于同一血清型.与国外发表的GPIC株及Mn株的MOMP比较,核苷酸序列的同源性分别为79.5%～80.4%和70.9%～71.3%.氨基酸序列的同源性分别为84.2%～84.7%和80.2%～80.5%.同时发现3菌株与GPIC株具有相似的基因可变区,而与Mn株的差异较大.     

番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC蛋白基因的克隆与序列分析

参考已发表的番鸭呼肠孤病毒(mDRV)的S4序列设计了1对扩增σC蛋白基因的引物,对mDRVZJ99株的RNA抽提物进行RTPCR扩增,获得了特异性的扩增片段。将PCR产物克隆测序,序列经同源性比较,发现mDRVZJ99株σC蛋白基因序列与福建MW9710株对应基因的同源性为99.5%,与法国89026株对应基因的同源性为94.2%,与法国89330株对应基因的同源性为95.0%;相应的氨基酸序列同源性分别为98.9%、94.1%、93.7%。基于σC基因及其推导氨基酸序列的蛋白质结构及物理化学性质预测结果,与国外学者对mDRVσC蛋白的报道相似。     

食蟹猴和猕猴朊蛋白基因的克隆与序列分析

以外周血液的基因组DNA为模板,运用PCR方法扩增了食蟹猴和猕猴的朊蛋白基因,并将其克隆到pGEM-T Easy载体中进行测序,运用分子生物学软件对这些序列进行了分析.结果表明,所克隆的食蟹猴和猕猴朊蛋白基因的开放阅读框片段包含了朊蛋白基因的完整编码区,含有762个核苷酸,该基因内无内含子,编码253个氨基酸的前体蛋白,推测其分子质量约27.6 ku.与已报道的其他多种动物朊蛋白基因序列做比较,发现其与多种哺乳动物都有较高的同源性,其中与人的同源性最高.氨基酸点突变分析除发现了已报道的多态性位点N97S、H100N外,在食蟹猴和猕猴均发现了未报道的S242L点突变位点.此外,在食蟹猴还发现了I8M、C151R点突变位点.     

黄牛发情期卵巢PGF2α受体基因的克隆分析及细胞内定位

为探讨发情期黄牛的卵巢和黄体上是否存在前列腺素PGF2α受体(PGF2αR)以及该受体在卵巢和黄体上的分布状况,利用分子克隆技术克隆了黄牛黄体、卵巢PGF2αR基因的部分序列;运用免疫组织化学技术对该受体在黄牛卵巢、黄体中的分布进行了细胞学定位;并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白质的基本理化性质、疏水性、二级结构、三级结构等方面进行了预测和分析。结果显示,黄牛PGF2αR基因在黄体的粒黄体细胞、膜黄体细胞均有表达;在卵巢的表达结果为颗粒细胞、卵泡内膜细胞、基质细胞,且均定位于细胞质中;该基因包含一个633bp的开放阅读框,编码210个氨基酸;其编码的蛋白质属于疏水性蛋白,二级结构主要以无规则卷曲和α螺旋为主。PGF2αR基因编码产物的同源性分析结果表明,黄牛PGF2α受体与绵羊的PGF2α受体具有高度同源性,达到91.80%。上述结果表明,黄牛PGF2αR基因的成功克隆及组织学细胞定位,为进一步研究哺乳动物前列腺素的生理作用提供了一定的基础资料。     

德州足螨副肌球蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的绵羊瘁螨副肌球蛋白基因序列(登录号为AM114275)设计了3对引物,采用RT-PCR法从德州足螨总RNA中克隆了副肌球蛋白基因,研究了该基因与部分螨类副肌球蛋白基因的同源性以及推导的氨基酸序列之间的同源性.结果显示,该基因全长2 628 bp,编码875个氨基酸,预测分子质量约为97.24 ku.与已报道的绵羊瘁螨、欧洲尘螨、美洲尘螨、人疥螨和热带无爪螨的副肌球蛋白基因同源性分别为95.5%、90.5%、89.4%、82.6%和79.5%,推导的氨基酸同源性分别为98.0%、97.0%、98.0 %、94.0%和89.0%.     

藏绵羊朊蛋白基因的原核表达

从藏绵羊全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPc)基因。测序分析表明,所克隆的羊PrPc基因片段大小为771 bp,包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列,其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21(DE3),挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达,收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明,PrP基因在大肠杆菌中成功表达,并能被抗牛PrPc单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%~45%,目的蛋白以包涵体的形式存在,包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。     

朊毒体蛋白的构象及其特性的研究进展

概述了朊毒体(包括构象不同的细胞型朊毒体和痒病型朊毒体)蛋白的构象特征、朊毒体及其突变体的特性,阐明了PrPsc是由PrPc通过构象转变而成的,不同物种PrP的三维结构有相似的球形结构域(125~228位)和N-末端无规卷曲尾,其球形结构域均由3个螺旋(144~154、173~194和200~228位)以及1对反平行的β-折叠(128~131和161~164)组成,但其结构和表面电荷分布存在一些区别。     

脂筏标记蛋白flotillin-2生理功能的研究进展

为了给进一步研究flotillin-2与某些神经退行性疾病(如海绵状脑病等)的关系提供参考,对脂筏标记蛋白flotillin-2的结构及其主要的生理功能进行了综述,提出,进一步研究flotillin-2与某些神经组织退化疾病及肿瘤的关系,对疯牛疯、克雅病、阿尔兹罕默氏病以及肿瘤病的发病机制及治疗研究具有重要意义。     

七种药物对微小牛蜱的半数致死浓度测定

用浸渍法测定了楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、哒嗪酮、螨净 7种药物对未吸血的微小牛蜱 (Boophilusmicroplus)幼蜱、若蜱、成蜱及其饱血雌蜱的半数致死浓度(LC50 )。结果显示 ,所用药物中半数致死浓度最低的 3种药物是楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤。植物性杀虫剂楝素对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为3.0 1～ 3.13、4 .37～ 4 .77、11.18～ 11.36、2 75 .5 0～ 2 76 .5 0mg/L ;植物性杀虫剂苦皮藤对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 4 .2 2～ 4 .4 2、10 .30～ 10 .5 0、82 .5 0～82 .70、6 35 .30～ 6 36 .70mg/L ;人工合成的除虫菊酯类的三氟氯氰菊酯对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 3.4 2～ 3.4 4、7.10～ 9.0 6、4 2 .30～ 4 2 .5 0、5 45 .5 0～5 46 .70mg/L。     

鸡朊蛋白的原核表达及其抗血清的制备

运用分子生物学方法分别构建了pGEX-4T-ChPrP1、pGEX-4T-ChPrP2、pGEX-4T-ChPrP3重组表达载体,经转化大肠杆菌BL21(DE3)和IPTG诱导表达,并对融合蛋白诱导表达时间、IPTG浓度进行优化,诱导表达的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白经GST-trap FF柱亲和层析纯化,用纯化后的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白免疫新西兰雄兔,以探究鸡朊蛋白的结构与功能。结果表明,本试验成功构建了pGEX-4T-ChPrP1、pGEX-4T-ChPrP2、pGEX-4T-ChPrP3重组表达菌,SDS-PAGE分析结果显示,得到大小为50、42和32ku左右的融合蛋白GST-ChPrP(25～247)、GST-ChPrP(96～247)、GST-ChPrP(174～247),与预期结果基本相符,在最适条件下每升pGEX-4T-ChPrP1菌液通过GST-trap FF层析柱获得的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白达10mg,制备的抗血清经琼脂糖凝胶扩散试验检测到较高的多克隆抗体效价(1∶32);Western-blot分析结果显示,融合蛋白GST-ChPrP(25～247)、GST-ChPrP(96～247)和GST-ChPrP(174～247)及鸡脑组织蛋白均可与该抗血清发生特异性免疫反应。证实,鸡重组朊蛋白具有良好的抗原性,与鸡脑组织朊蛋白具有相同的抗原成分。     

传染性羊痒病抗性基因分型方法的建立

根据GenBank中登录的绵羊朊蛋白编码基因PRNP序列,设计并合成了可用于单核苷酸多态性(SNP)快速分析的3对引物和7条分别标记了FAM和VIC荧光染料的MGB探针,建立了一种利用荧光定量PCR扩增反应对羊痒病抗性基因进行筛选的方法。结果表明,设计的引物及探针具有特异性和高效扩增性,能够用于PRNP羊痒病抗性基因的快速分型。借助该方法可建立一整套完善的预警监测体系来预防该病的发生,也可用于羊痒病的常规实验室诊断。     

牛朊蛋白单氨基酸变异体的原核表达

应用pGEX原核表达载体构建了牛朊蛋白的1个正常重组蛋白和3个单氨基酸变异体的原核表达质粒,即pGEX BoPrP(93~241)、pGEX BoPrP(93~241)(S154N)、pGEX BoPrP(93~241)(A129V)和pGEX BoPrP(93~241)(Q234R)。经转化E.coli BL21 (DE3),均表达了预期大小约为42.4 ku的融合蛋白。在优化的诱导表达条件下,各重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30%~45%的融合蛋白。经免疫印迹检查,所有融合蛋白均可与抗牛单克隆抗体4C11 反应。表明,单氨基酸突变并不影响单抗4C11的识别表位。