用SPA-固相免疫电镜技术诊断犬细小病毒性肠炎

(一)材料与方法 1.被检粪样和肠内容物处理:新疆某警犬所出现呕吐、血样腹泻的病犬5只,采其粪样或病死犬肠内容物,分别编号为1、2、3、4、5号,按1/2(V/V)量加入0.01MpH7.6的PBS,充分振摇,冻融2次,再加入等量氯仿充分振荡后,3000rpm离心30分钟,吸取水相待检。 2.抗体:①西德产Magioban,该制品为含有犬瘟热、犬腺病毒肝炎、犬钩体、犬细小病毒的狗免疫球蛋白,批号为23795。②猫泛白细胞减少症阳性血清、南京农大蔡宝祥教授惠赠。     

犬细小病毒SH14株的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

为分离犬细小病毒(canine parvovirus,CPV),用疑似犬CPV感染的病犬肠组织研磨液接种猫肾细胞(CRFK),进行病毒分离,并利用常规病毒学和分子生物学方法以及动物回归试验鉴定分离的病毒,并对其VP2基因序列进行测定及分析。结果显示,该病毒能在CRFK细胞上良好生长并产生细胞变圆、脱落等特征性细胞病变;细胞培养物能扩增出CPV的特异性基因组;对病毒的VP2基因序列和推导的氨基酸序列进行分析,结果表明,本研究的分离毒株属于New CPV-2a型,与CPV SH-2/2011株的亲缘关系最近,其核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为99.83%和100%。上述结果表明,成功分离到1株New CPV-2a型犬细小病毒,将其暂命名为SH14株。本研究结果为进一步研究我国犬细小病毒的进化和变异,以及疫苗的研制奠定了物质基础。     

犬细小病毒SH15株的分离鉴定与全基因组分析

为了解上海地区犬细小病毒的流行及其变异情况,从疑似犬细小病毒感染的死亡犬采集各种组织,无菌处理病料后同步接种F81细胞,盲传至第5代出现细胞病变,从肠组织中分离出1株病毒。采用电镜进行病毒形态学观察,以及HA、HI和PCR等方法鉴定病毒,结果证实为犬细小病毒,命名为CPV-SH15。该病毒的血凝效价为2~9,病毒TCID_(50)为10~(5.2)/m L,测得病毒编码区基因序列的全长为4 869 bp,与上海分离毒株CPV/CN/SH1/2013的同源性为99.8%,亲缘关系较近,说明上海地区的犬细小病毒的遗传变异并不明显。对其VP2基因的氨基酸序列进行分析,确定该细小病毒属于New CPV-2a亚型。该研究为犬细小病毒遗传进化的进一步研究奠定了基础,从而为犬细小病毒病疫苗的研制以及防控提供参考。     

犬细小病毒JL-(18)1/Beagle株的分离鉴定及遗传进化分析

为研究犬细小病毒(CPV)流行株遗传变异情况,本研究从吉林省某比格犬养殖场采集疑似CPV感染致死犬的肠道组织,将病料接种至F81细胞进行病毒分离,并通过电镜形态学、PCR、血凝试验及动物回归试验进行鉴定。结果显示,所分离的这株病毒在F81细胞中产生了典型CPV细胞病变(CPE);在电镜下可见病毒呈无囊膜、直径为20 nm左右的病毒粒子;PCR鉴定证实CPV核酸呈阳性;血凝试验表明此病毒对猪红细胞具有凝集作用,血凝效价为1∶256;将这株病毒命名为JL-(18)1/Beagle。动物回归试验表明,JL-(18)1/Beagle使比格犬产生犬细小病毒感染的典型临床症状;以NS1基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与CPV-2c型分离株CPV-SH1516以及Canine/China/23/2017 NS1基因亲缘关系较近,而核苷酸相似率为100%;以VP2基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与New CPV-2b型CPV/CN/JL3/2013、CPV/CN/HB1/2013和CPV/CN/JL6/2013亲缘关系较近,核苷酸相似率为99.89%~99.94%;以VP2蛋白氨基酸进行序列分析表明,JL-(18)1/Beagle属于New CPV-2b型,与近期吉林CPV分离株相比,关键氨基酸位点无明显变化。因此,本试验从吉林省比格犬肠组织中分离到1株New CPV-2b型CPV毒株。     

狼体内犬细小病毒的分离

犬细小病毒 (Canineparvovirus ,CPV )最早在1978年分别从澳大利亚和加拿大患肠炎的病犬中分离获得。CPV可导致犬出血性腹泻和心肌炎 ,在幼犬中发病率和死亡率都很高。该病后来在美国、英国、法国、德国等国家相继发生 ,已经成为犬的一种重要传染病。我国也有该病的暴发流行 ,并已获得多株病毒。 2 0 0 3年 3月 ,北京市某野生动物园饲养的狼突然发病死亡 ,生前有腹泻症状 ,粪便潜血 ;尸体剖检可见出血性、坏死性肠炎 ,经实验室诊断 ,确诊其为犬细小病毒感染。1　材料与方法1.1　病料　分别采集病死狼的肠道、肝、肺、脾以及同群发病但未…     

犬细小病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

参照GenBank中犬细小病毒(CPV)VP2基因保守区域序列设计合成特殊的内、外引物,在扩增反应体系中加入荧光染料SYBR GreenⅠ,通过恒温荧光检测仪Deaou-308C扩增检测,建立了一种快速检测CPV的实时荧光环介导等温扩增(LAMP)方法。结果显示,这种方法对CPV具有特异性的扩增反应,对照病毒核酸的扩增结果均为阴性。灵敏度试验最低可检出3.72 copies/μL的病毒核酸。重复性试验结果表明,其检测重复性良好。对30份临床宠物犬的粪便样品进行检测,与免疫胶体金检测试纸方法进行比较,符合率为90%。将本方法初步应用于大熊猫粪便中犬细小病毒的检测,结果表明,从大熊猫基地采集的84份粪便样品中有16份为细小病毒阳性,阳性率为19.0%。本方法在63℃下恒温45 min可以完成检测,操作简单、灵敏度高、特异性强,通过恒温实时荧光检测仪可实时检测及自动判读检测结果,对大熊猫的早期诊断非常重要。     

犬细小病毒广西流行株的分离鉴定及生物学特性分析

为了解当前犬细小病毒广西地方毒株的生物学特性,本研究收集广西各地疑似犬细小病毒(CPV)感染病犬的粪便通过接种F81细胞进行病毒的分离培养,并通过血凝试验、抗性分析、同源性分析和攻毒试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究。结果显示,接种3代后,细胞出现明显的病变(CPE),血凝效价为1∶512,第5代病毒的TCID_(50)为1×10~(-3.6)/0.1 m L,能抗热、酸、氯仿和乙醚;电镜观察到CPV为直径约25 nm圆形、无囊膜的结构,应用CPV特异性引物检测到长约1 419 bp和1 254 bp的特异性条带,提示成功分离到一株犬细小病毒毒株;测序分析结果表明,VP2基因与周边国家地区及我国各地方的参考毒株、流行株核苷酸同源性为98.9%~99.8%;系统进化发生分析表明,广西分离株的基因型为CPV-2a亚型,与泰国参考毒株VT148亲缘关系最近;与其它CPV-2a亚型相比,分离株的第267位、305位、324位和440位氨基酸位点发生了变异;动物回归试验结果表明,犬细小病毒广西分离株属于强毒株。本研究成功分离到犬细小病毒广西地方流行株,并对其主要衣壳蛋白VP2基因进行遗传变异分析,为更好的预防和控制犬细小病毒提供依据。     

貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.     

FPLV、LPV、CPV三种细小病毒的比较研究

用琼脂扩散试验(AGP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和限制性核酸内切酶技术比较了我国分离的猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)、云豹细小病毒(LPV)和犬细小病毒(CPV)的相关性。结果表明,在AGP中,纯化病毒(FPLV、LPV和CPV)混和液与3种病毒抗血清分别形成的沉淀线完全吻合;在ELISA中,OD值差异不显著(P>0.05);限制性核酸内切酶HaeⅢ、HindⅢ的酶切图谱初步显示,FPLV、LPV和CPV核酸电泳区带数目和位置均相似。     

ICHV感染细胞的免疫胶体金扫描与透射电镜对比观察

本实验应用免疫胶体金扫描与透射电镜对犬传染性肝炎病毒(ICHV)感染的培养细胞进行对比观察,旨在为病毒—细胞间相互作用的研究提供一些形态学依据。 (一)材料与方法 1.病毒:系本所病毒室从犬传染性肝炎病犬的病料中分离并经鉴定的ICHV A-8301株的第5代细胞培养物。 2.细胞:为犬肾传代细胞,引自中国兽药监察所。 3.豚鼠抗ICHV lgG:自制,其血凝抑制试验滴度为1:64。 4.胶体金标记葡萄球菌A蛋白(SPA-G):购自军事医学科学院。透射电镜用金颗粒直径为10nm,扫描电镜用金颗粒直径为20nm。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白基因序列,设计合成了1对特异性引物,以CDV疫苗株ONP为模板,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测CDV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RT-PCR扩增,能得到与理论设计值大小一致的242bp的特异性条带;该方法最低可以检测出约20pg含量的CDV;对已知CDV阳性和阴性病料进行重复性和稳定性试验,结果均一致;用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)和同为副黏病毒科的新城疫病毒(NDV),均无交叉反应;对32份临床病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测试纸检测结果进行比较,符合率为93.75%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,重复性和稳定性均好,可用于犬瘟热病毒的临床诊断和试验研究。     

CDV和CPV及CCV多重纳米PCR检测方法的建立与应用

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)N基因序列、犬细小病毒(CPV)VP2基因序列和犬冠状病毒(CCV)M基因序列的保守型片段分别设计特异性引物,建立了CPV(193 bp)、CDV(500 bp)和CCV(780bp)的多重纳米PCR(nano-mPCR)检测方法,同时考查所建立nano-mPCR检测方法的特异性和敏感性。结果表明,该方法特异性和敏感性良好,对CPV、CDV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10~2、6.0×10~2和6.7×10~2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。临床样品的检测结果表明,nano-mPCR的建立为CDV、CPV和CCV的单独或混合感染进行早期快速、灵敏、准确的鉴别诊断提供了新方法。     

番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)基因组的非同源序列各设计了1对引物MDPVF1/R1和GPVF1/R1,建立了一种PCR方法,用该PCR方法分别对GPV、MDPV、鸭瘟病毒(DPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、犬细小病毒(CPV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)的病毒培养物及其核酸进行扩增。结果,引物MDPVF1/R1仅特异性扩增出MDPV的900 bp核酸片段,引物GPVF1/R1仅特异性扩增出GPV的465 bp核酸片段。表明,建立的PCR方法可用于GPV和MDPV的鉴别诊断。     

MDCK细胞感染犬细小病毒后的差异表达谱分析

通过了解MDCK细胞感染犬细小病毒(CPV)后基因表达水平的差异,研究病毒对细胞的致病作用以及细胞抵御病毒感染的机制。利用表达谱基因芯片技术,分析持续感染犬细小病毒的MDCK细胞基因表达水平的变化情况,并用Real-Time PCR技术加以验证。结果显示,获得了359个差异大于1.5倍的表达基因(P0.05),占总基因数的1.53%,其中193个上调表达(0.84%),166个下调表达(0.69%)。对差异基因进行GO功能聚类分析,小部分涉及免疫应答、生长周期调控、信号转导和蛋白酶活性,其他大部分基因功能未知。利用Real-Time PCR随机验证5个基因在持续感染CPV后的差异表达,其结果和芯片杂交的结果一致。表明建立了MDCK细胞持续感染CPV后的差异表达谱,初步了解到CPV对宿主细胞的制约作用,引起部分细胞增殖调控相关基因发生了表达下调,以及细胞对感染的积极应答反应,部分免疫反应基因、肽链内切酶活性基因等发生了上调表达,从而为探索病毒的致病机理和宿主的抗病毒途径提供了试验基础。     

疑似犬细小病毒病的调查

犬细小病毒病,最早发现于美国(1978年),以后蔓延全世界。病毒从感染犬的粪便,尿液、呕吐物、唾液中排出,此病毒抵抗力很强,在粪便中能存活一周。康复犬仍可长期带毒,对犬危害严重。 (一)流行情况 犬细小病毒病散在发生,呼兰县自1982至1985年止,全县21个乡镇,300多个大队均有本病发生和流行。其中1982年呼兰镇有犬5500只,发病275只,发病率为5％,     

应用SPA-固相免疫电镜法检测口疮病毒

我们在进行骆驼传染性口疮病原分离鉴定研究中,采用SPA—固相免疫电镜法检测口疮病毒,获得较好效果。 (一)材料和方法 1.抗原 (1)骆驼传染性口疮病毒:取自人工感染发病驼痂块,按常规方法作1:10(W/V)稀释,—20℃冻结保存,使用前水浴融化,4000rpm离心30分钟,取上清备用。     

三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析。结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/m L、3.5×103TCID50/m L、1.0×104TCID50/m L;3株CPV分离株VP2基因的核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与30株来自不同国家和地区的CPV参考株同源性分别为98.1%～99.9%。VP2基因序列进化树显示,3株CPV分离株与CPV-2型(疫苗株)、CPV-2a型、CPV-2b型、New CPV-2a型、New CPV-2b型及国外CPV-2c型毒株的亲缘关系较远,与国内CPV-2c型毒株的亲缘关系较近;根据VP2蛋白第426位氨基酸位点的分子特征,证明这3株CPV分离株均为CPV-2c型毒株。该结果为近期江苏省CPV分子流行病学调查提供了依据。     

犬瘟热病的电镜诊断

我们采用电镜技术,对兰州市一例病犬的病料进行了观察,确诊了该犬患犬瘟热病。病料的处理 选取病变小肠一段,刮取肠粘膜约1g左右置乳钵中,加少量玻璃砂,充份研磨,在低温冰箱冻融2次,用0.1mol PBS液使其成20％的悬液,充份搅匀,用2000r/min离心20分钟,取上清液,再以3500r/min离心1小时,弃去上清液,将沉淀物用1～2滴双蒸水悬浮起。并将其滴附在有Formvar膜的载网上,吸附1分钟,以1％磷钨酸负染1分钟,再用泸纸条吸干多余的水份,干燥后电镜观察、     

犬圆环病毒及犬细小病毒双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测犬圆环病毒(CanineCV)和犬细小病毒(CPV)的方法,根据CanineCV和CPV基因组的保守区域设计2对特异性引物,预期特异性扩增CanineCV和CPV的片段大小分别为984和668 bp。并将反应条件进行优化,建立了CanineCV和CPV的双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增CanineCV和CPV的目的条带,且未扩增出其他犬胃肠道病原;CanineCV和CPV的最低检出限分别为85.7和312 copies/L。对采集自广西地区的223份临床样品的检测结果显示,CanineCV的阳性率为2.24%(5/223)、CPV的阳性率为5.38%(12/223),后者与常规PCR检测方法相一致。结果表明,建立的双重PCR方法可以用于CanineCV和CPV的检测和流行病学调查。     

番鸭呼肠孤病毒乳胶凝集试验检测方法的建立

建立了用纯化的抗番鸭呼肠孤病毒(DRV)抗体致敏乳胶检测DRV抗原的方法。通过试验,确定抗体致敏乳胶的最佳浓度为1∶10(IgG蛋白浓度为0.424 2 mg/mL),最佳致敏温度为37℃,最佳致敏时间为120 min。用所建立的方法对人工感染的1 日龄雏番鸭30 只进行粪便检测,结果表明,感染后第3 d粪便中即可检测到病毒,直至人工感染鸭全部死亡都可从粪便中检出病毒抗原;对同样人工感染的30只1日龄雏番鸭的心、肝、脾病料用所建立的方法检测,结果表明,感染后第4 d,2/3番鸭脾病料检出阳性;感染后第5 d,2 只死亡鸭中有1 只肝病料检出阳性,脾病料2只都呈阳性;此后的病死鸭脾和肝病料均为阳性,而心则未检出阳性。