皮肤成纤维细胞纤维连接蛋白及其EDA、EDB表达与损伤时间的关系

目的研究培养的皮肤成纤维细胞纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及其可变剪接片段EDA、EDB在损伤后的mRNA水平,为推断早期损伤时间提供参考指标。方法培养人体皮肤成纤维细胞,换无血清培养液培养24h后,采用划痕法制作细胞损伤模型,损伤后0、0.5、1、2、6、24h收集细胞,抽提RNA,实时RT-PCR定量检测总FN及其EDA、EDB的mRNA水平的变化。结果皮肤成纤维细胞中总FN及其EDA、EDB的mRNA水平随损伤时间的延长而升高,EDA mRNA在损伤后1h达到高峰,EDB mRNA在损伤后6h达到高峰,FN mRNA在损伤后2h达到高峰;在损伤1h后总FN及其EDA、EDB的mRNA表达变化随时间的延长而呈现一种不断上升的趋势。结论纤维连接蛋白EDA、EDB可作为早期损伤时间推断的较理想的参考指标。     

人皮肤成纤维细胞早期损伤后EDA-FN表达与损伤时间的关系

目的探讨培养的人体皮肤成纤维细胞损伤后纤维连接蛋白EDA片段的表达情况与损伤时间的关系。方法培养人体皮肤成纤维细胞,利用单克隆抗体进行免疫组织化学染色及Western检测。结果培养中的人体成纤维细胞可以微量表达EDA,随损伤时间延长而表达量增加。结论EDA片段表达变化可以作为法医学早期损伤时间推断的比较理想的指标。     

FN－Ⅲcs在皮肤切创中的表达与损伤时间关系

目的研究纤维连接蛋白可变剪接片段Ⅲcs在不同损伤时间皮肤中的表达,为早期损伤时间的判定指标提供实验依据.方法DIG标记反意RNA探针,以原位杂交的方法检测大鼠和人体皮肤在损伤早期FNⅢcs表达的变化.结果(1)人体及大鼠皮肤损伤后30min皮肤网状层的毛囊、皮脂腺、血管内皮层中表达FNⅢcs的阳性细胞数开始增多,至伤后6h达到高峰,以后又逐渐减少.(2)人体皮肤FNⅢcs表达的部位与大鼠有明显的差异.结论FNⅢcs的原位检测可望成为判断早期损伤时间的有用指标;为FNⅢcs在创伤修复中的合成方式、部位和作用的研究提供了实验基础.     

大鼠皮肤损伤后纤维连接蛋白剪接异型体的表达

运用地高辛标记纤维连接蛋白 (FN)特殊位点的探针 ,通过原位杂交方法检测不同损伤时间大鼠皮肤各型FN剪接异型体的表达情况 ,结果发现 :伤后大鼠皮肤各型FN的表达随时间呈增高趋势 ;伤后 30～ 6 0min表达出正常皮肤中没有的EⅢA、EⅢB片段。FN的这一特性为法医学诊断生前、死后伤和伤后存活时间推断提供了新指标。     

大鼠皮肤降钙素基因相关肽表达与损伤时间的相关性

目的探讨创伤皮肤组织降钙素基因相关肽(CGRP)的时间相关性表达,为损伤时间推断提供实验依据。方法应用免疫组化技术、图像分析技术和原位分子杂交技术检测不同损伤时间大鼠皮肤组织生前及死后CGRP表达。结果生前组大鼠损伤后皮肤组织内CGRP在神经纤维中表达明显高于对照组(P<0.05)。死后组皮肤组织中CGRP表达与正常对照组比较无明显变化(P>0.05)。生前组中CGRP表达在损伤后1h明显增多,4h达到高峰,以后恢复到正常。结论损伤组织神经纤维中CGRP表达具有规律性且有较好的时间相关性,可成为法医学损伤时间推断的指标。     

Fn-EIIIA金标试纸条进行损伤时间推断的效果评价

目的评价Fn-EIIIA金标单克隆抗体试纸条在人体皮肤组织损伤时间推断中的有效性和灵敏度。方法提取不同损伤时间人体皮肤组织,匀浆,用Fn-EIIIA金标单克隆抗体试纸条检测其Fn-EIIIA的表达,对其结果进行评价;同时,将大鼠挫伤皮肤组织置于自然环境中,分别提取不同自溶时间段的皮肤样本进行检测,对自溶变化对检测结果的影响进行观察。结果正常皮肤组织样本中试纸条检测线不显色,损伤1h后即显色,随损伤时间延长,试纸条检测线有显色逐渐加深的趋势;在观察时间段内,组织自溶对检测结果无显著影响。结论Fn-EIIIA金标单克隆抗体试纸条可作为法医学损伤时间推断敏感、稳定的检测手段。     

EIIIA＋纤维连接蛋白在大鼠皮肤切创的表达

目的：探讨大鼠皮肤切创纤维连接蛋白EIIIA片段的表达与损伤时间的关系。方法取48只成年SD大鼠并切割大鼠背部皮肤致伤。于伤后即刻、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h共8个时间段分别处死大鼠,取其创伤周围皮肤,利用免疫组织化学方法和Western印迹法检测EIIIA＋纤维连接蛋白,观察其表达水平与损伤时间的关系。结果伤后即刻未出现EIIIA＋纤维连接蛋白的表达,伤后0.5 h,皮肤基底细胞开始出现阳性表达,随损伤时间的延长,阳性着色持续增强。 Western印迹法检测发现,所测得的相对光密度值随损伤时间的延长而逐渐增高。结论 EIIIA片段表达变化可以作为法医学早期损伤时间的推断指标。     

大鼠骨骼肌挫伤后Fzd2表达与损伤时间的关系

目的检测大鼠骨骼肌挫伤后卷曲受体蛋白2(frizzled-2,Fzd2)mRNA及其蛋白表达量与损伤时间的关系,探讨其是否可以作为损伤时间推断的指标。方法利用RT-qPCR和Western印迹法检测正常对照组及损伤后4~48 h每4 h大鼠骨骼肌中Fzd2 mRNA和蛋白水平的表达量。结果 Fzd2 mRNA在损伤后24 h、36 h、40 h相对表达量增高,24 h组表达量达正常对照组的两倍(P0.05);而Fzd2蛋白在损伤后相对表达量变化不明显(P0.05)。结论大鼠骨骼肌损伤后Fzd2 mRNA在一定时间内的表达变化情况可以作为多指标联合推断损伤时间的依据。     

Fn-EⅢA金标试纸条进行损伤时间推断的效果评价

目的评价Fn-EⅢA金标单克隆抗体试纸条在人体皮肤组织损伤时间推断中的有效性和灵敏度.方法提取不同损伤时间人体皮肤组织,匀浆,用Fn-EⅢA金标单克隆抗体试纸条检测其Fn-EⅢA的表达,对其结果进行评价;同时,将大鼠挫伤皮肤组织置于自然环境中,分别提取不同自溶时间段的皮肤样本进行检测,对自溶变化对检测结果的影响进行观察.结果正常皮肤组织样本中试纸条检测线不显色,损伤1h后即显色,随损伤时间延长,试纸条检测线有显色逐渐加深的趋势;在观察时间段内,组织自溶对检测结果无显著影响.结论Fn-EⅢA金标单克隆抗体试纸条可作为法医学损伤时间推断敏感、稳定的检测手段.     

大鼠皮肤创伤后EⅢA-FNmRNA表达与损伤时间推断研究

目的研究皮肤创伤后不同时间纤连蛋白剪接方式变化及EⅢA剪接异型体的表达。方法提取伤区组织总RNA,RT-PCR方法扩增目的条带。结果大鼠皮肤损伤后表达出正常组织中没有的EⅢA+(526bp)片段,其中伤后1h该条带肉眼可辨认,在伤后24h内,随损伤时间延长其条带亮度相应升高。结论EⅢA-FN剪接异型体表达变化可为法医学损伤时间推断较理想指标。     

大鼠皮肤切创后E-选择素表达及稳定性研究

目的探讨大鼠皮肤切创后E-选择素表达规律及法医学意义。方法健康SD大鼠90只,随机分成4组：正常对照组、活体切创组（30min～7d12个时间点）、死后切创组（30min～3h3个时间点）、死后稳定性组（-20％6h-7d9个时间点,25％6h～3d5个时间点）。在大鼠头部建立皮肤切创模型,按设定的时间点取皮肤检材,运用免疫组化和图像分析技术,检测血管内皮E-选择素的表达规律。结果在活体切创组中,伤后1hE-选择素在血管内皮细胞内即呈阳性表达,持续至伤后7d,且随时间变化呈规律性表达。在正常对照及死后切创组未见阳性表达。死后-20％稳定性组各时间点E-选择素表达与死后即刻比较无显著性差异（P〉0．05）。25％各时间点与死后即刻比较有显著性差异（P〈0．01）。结论E-选择素在创伤后血管内皮细胞内特异性的表达具有时序性规律,且低温条件下稳定性较好。     

小鼠皮肤切创愈合过程中c-jun的表达

目的探讨小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区c-jun的表达及不同损伤时间c-jun的变化规律。方法应用免疫组织化学染色和Western印迹技术检测小鼠皮肤切创后各个时间段c-jun的表达变化情况。结果正常组织中有少量c-jun表达。伤后3～12h损伤区c-jun主要表达在中性粒细胞中,1～5dc-jun阳性细胞主要以单个核细胞和成纤维细胞为主,7～14dc-jun主要在成纤维细胞中表达。阳性细胞率3～12h逐渐增高,12h达高峰,1～5d有所下降,7d阳性细胞率达第二峰值,10～14d逐渐降低。Western印迹法检测显示各个时间段均有c-jun阳性条带,其中12h和7d为c-jun含量的2个高峰。结论小鼠皮肤切创愈合过程中c-jun在损伤区对诱导中性粒细胞、单个核细胞及成纤维细胞的凋亡可能起着重要作用,同时c-jun表达的规律性变化可用于损伤时间的推断。     

大鼠脑干损伤早期c-fos原癌基因的原位杂交研究

目的　探讨原癌基因c-fos蛋白的表达和脑干早期损伤的关系。方法　 2 0只实验大鼠随机分为脑干损伤组和对照组 ,脑干早期损伤阶段c-fos蛋白表达采用原位杂交组化法观察。结果　对照组大鼠脑干组织未见c-fosmRNA的表达。然而 ,脑干损伤组损伤后 1 0min即可在神经元和胶质细胞观察到c-fosmRNA的表达。且在脑干损伤后 3h内 ,c-fosmRNA的表达程度出现明显的时间依存性。脑干组织死后伤c -fosmRNA的表达亦为阴性。结论　c-fos原癌基因的检测可成为诊断脑干生前损伤的一项指标。     

在大鼠皮肤切创愈合过程中TGF-β_1基因及蛋白表达变化与损伤时间关系的实验研究

了解细胞因子在创伤及修复过程中的表达变化与损伤时间的关系。初步调查生前不同造创时间 ( 0 5h～16 8h)皮肤创缘组织在修复过程中TGF β1mRNA和蛋白质表达变化 ,并与死后伤 ( 0 5h～ 6h)上述变化进行比较。结果表明 ,在生前伤 ,TGF β1在上皮细胞的表达于损伤后 0 5h开始增强 ,以 2 4h～ 96h反应最强 ,除上皮细胞内表达外 ,还在肉芽组织的巨噬细胞和成纤维细胞表达。TGF β1的免疫印迹 (WesternBlot)分析表明 ,TGF β1蛋白表达的峰值在 16 8h ;TGF β1斑点杂交和原位杂交结果显示 ,mRNA的表达在伤后 3h开始 ,6h后明显 ,96h达峰值。死后损伤组在 0 5～ 3h内有免疫组化的弱～中度表达 ,但无mRNA的表达 ,3h后则均无任何表达。TGF β1在修复过程中的一些规律性变化及特点反映了与损伤时间的关系 ,可作为精确推断损伤时间的分子生物学标志。     

人皮肤组织刺、切创后IL-8表达的免疫组织化学研究

为探讨人皮肤刺、切创后白细胞介素 8(interleukin 8,IL 8)在推断皮肤损伤时间中的应用价值 ,本研究应用免疫组化技术对 5 2例不同损伤时间人体皮肤刺、切创组织中IL 8的表达进行了研究。伤后 4h的损伤皮肤组织中可见部分的多核粒细胞表达IL 8。伤后 12～ 2 4h ,大部分浸润的多核粒细胞及部分单核细胞为IL 8阳性。随伤后时间延长 ,IL 8阳性细胞以单核及成纤维细胞为主。伤后 4～ 6h的皮肤中 ,IL 8阳性细胞比率较低 ,为 16 0±10 1%。伤后 1～ 4d达高峰 ,为 5 9 6± 8 7%。其后逐渐减少。本研究结果表明 ,IL 8的表达可用于皮肤刺、切创后损伤时间的推断。     

大鼠皮肤切创愈合过程中Cygb及HIF-1α mRNA的表达

目的探讨皮肤切创愈合过程中Cygb及HIF-1αmRNA表达的相关性及时间变化规律。方法 60只健康雄性SD大鼠随机分为9个实验组和1个正常对照组,建立大鼠皮肤全层切创模型,实验组分别于术后0、1、3、6、12、24、48、72、96h脱颈处死大鼠,提取创周皮肤总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测Cygb及HIF-1αmRNA的表达,实验组与对照组及各组间进行比较分析。结果 Cygb与HIF-1αmRNA创伤后表达的总体变化趋势基本一致,均于伤后12h首次达峰,分别为对照组的1.6倍和5.4倍(P<0.05);随后下降,并分别于伤后48h、72h再次升高,至96h达对照组的2.8倍和5.6倍(P<0.05)。结论大鼠皮肤切创愈合过程中Cygb与HIF-1 mRNA的表达呈现时序性变化且有一定的相关性,可作为皮肤损伤时间推断的指标。     

细胞因子(IL-6、TNF-α)在损伤时间中原位杂交法研究

采用原位杂交法，研究大鼠切削皮肤中细胞团子IL－6、TNF－αmRNA表达量，旨在探讨IL－6、TNF－α推断法医损伤时间的应用价值以及其在损伤生活反应中的分子机制。研究结果表明，根据大鼠损伤皮肤中TNF－αmRNA表达量能够区别生前伤与死后伤，并可以利用TNF－αmRNA表达量改变准确区别60min内和60min后损伤时间，但IL－6mRNA表达量在研究组内均未见阳性反应，不能推断损伤时间。