猪源脑心肌炎病毒GXLC株对仔猪的致病性试验

为研究猪源脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株对仔猪的致病性,将其接种4周龄健康断乳仔猪,观察临床症状及病理变化,检测心、脑、脾组织及血清中的病毒含量,测定血清抗体效价,检测心、脑、脾组织中IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA的表达水平。结果显示,仔猪感染后,出现体温升高、精神不振、腹泻等症状;剖检发现心包积液,心脏变软,脑充血;组织病理学观察发现心肌炎、脑炎,病理炎症分值显著提高;心、脑、脾、血清中均可检测到大量病毒;血清中出现高效价的中和抗体;感染仔猪心、脑、脾组织中IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA的表达水平显著上调,而且细胞因子的表达高峰期与出现临床症状、病理损害的时间密切相关。表明,猪源EMCV GXLC株对仔猪具有致病性,IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎细胞因子在EMCV对仔猪的致病过程中发挥重要作用。     

PDCoV和PEAV二重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)是两种新发现的猪传染性冠状病毒,临床上均以腹泻症状为主,症状相似,临床上难以快速诊断。为建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重RT-PCR方法,本研究根据PDCoV和PEAV N基因序列,分别设计2对特异性引物,以阳性质粒为模板,对二重RT-PCR反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性试验。结果显示,所建立的方法能够扩增出PDCoV和PEAV的特异性片段,大小分别为690 bp和208 bp,且对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)无扩增条带;对PDCoV和PEAV的最低检测量分别为5.13×102copies/μL、4.73×101copies/μL。对60份临床腹泻样本病料进行检测,结果PDCoV的检出率为21.6%,未检测出PEAV。本研究所建立的二重RT-PCR方法可用于临床流行病学监测,为快速诊断PDCoV和PEAV提供理论依据和技术支持。     

地衣芽孢杆菌对坏死性肠炎雏鸡回肠组织及细胞因子的影响

为了探讨地衣芽孢杆菌对坏死性肠炎雏鸡回肠组织及细胞因子的影响,选用1日龄铁脚麻鸡120只,随机将其分为对照组、感染组、预防组(1g/kg菌粉Ⅰ),治疗组(0.5g/kg菌粉Ⅰ+4g/kg菌粉Ⅱ)。感染组、预防组、治疗组15日龄灌喂球虫,17~20日龄灌喂产气荚膜梭菌(1×108CFU/mL)1mL,对照组灌喂相同剂量生理盐水。采用Real-time PCR方法检测回肠组织中IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6等4种细胞因子的表达水平,切片观察回肠组织变化。结果,产气荚膜梭菌的攻毒使雏鸡外周血白细胞及回肠组织细胞因子显著增加,回肠组织切片可见明显病变。地衣芽孢杆菌的补充减少了肠道病变及外周血白细胞数量。此外,与感染组相比,治疗组IFN-γ、IL-1β、IL-6的表达水平均显著降低,而预防组仅IL-1β显著低于感染组,其他细胞因子的表达无差异。结果表明,地衣芽孢杆菌对试验性雏鸡坏死性肠炎的防治具有促进作用。     

早期断乳应激性腹泻对仔猪肠道形态结构与肠道菌群的影响

为研究早期断奶应激性腹泻对仔猪肠道形态结构和肠道菌群的影响,选取21日龄体况相近的早期断奶腹泻仔猪6只,于腹泻次日采集各肠段样本进行病理组织学观察,并测定其肠道菌群。结果显示,早期断奶应激性腹泻仔猪的十二指肠黏膜呈轻度卡他性炎,黏膜上皮脱落,核溶解,绒毛稀少;空肠和回肠肠绒毛脱落,顶端凝固性坏死;空肠和直肠固有层大量中性粒细胞、巨噬细胞浸润;各段肠上皮细胞出现充血、出血、水肿、空泡变性等形态结构的改变。仔猪肠道菌群改变,主要表现为与健康仔猪相比,腹泻仔猪各肠段的类杆菌、大肠杆菌、梭菌数量显著升高(P<0.05),双歧杆菌、乳杆菌数量显著降低(P<0.05)。证实早期断乳应激性腹泻能引起肠道形态结构的破坏和肠道菌群失调,从而加重仔猪腹泻。     

马齿苋多糖对猪流行性腹泻病毒抑制作用的研究

提取马齿苋多糖(POP),研究它对猪流行性腹泻病毒(PEDV)体外复制的作用及机制。采用醇沉法提取POP并用纯化,选用VH细胞为模型细胞,检测纯化后的多糖对该细胞的细胞毒性。用PEDV感染VH细胞,建立体外病毒感染模型,用CCK-8和RT-q PCR的方法检测POP对细胞的保护和对病毒的抑制效果以及作用于病毒感染的时期,免疫荧光观察其对病毒复制的作用,并通过ELISA方法检测POP对体外PEDV感染模型分泌IFN-α、TNF-α、IL-6等细胞因子的影响。结果显示,POP浓度在0～25 μg/m L范围内对VH细胞无毒副作用;浓度为6.25～25 μg/m L时对PEDV具有明显的抑制作用,并呈一定的剂量依赖性,免疫荧光可以清晰观察到其对病毒复制的抑制作用。该药物主要作用于病毒感染的吸附期;其对PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6的分泌的抑制作用显著(P0.01)。由此得出:POP对PEDV感染的VH细胞具有明显的抑制作用,能抑制PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α、IL-6的蛋白含量的增加,从而发挥抗病毒的作用。     

一起猪增生性肠病的诊断

20 0 3年 3月 ,广东省清远市某猪场后备猪发生以肠道出血、拉血便为特征的传染病 ,经病理剖检和PCR检测 ,诊断为猪增生性肠病。1　发病情况2 0 0 3年 3月 ,清远市某猪场有数只后备猪发生血便 ,以后又陆续有猪出现相似的症状 ,病猪表现拉带血稀便、发热、皮肤颜色苍白和食欲下降 ,但未出现死亡。2　病理剖检2 .1　大体病变　主要集中表现在消化道。回肠肠管外形变粗 ,肠壁增厚 ,肠壁浆膜面有明显的脑回样花纹 ;肠腔内有大量条状凝血块 ,肠黏膜明显增厚 ,皱折成脑回样皱壁 ;黏膜表面无光泽 ,有少量坏死组织碎片。盲肠和结肠外观呈暗紫色 ,肠…     

禽呼肠孤病毒感染鸡胚成纤维细胞后三种细胞因子基因mRNA转录水平的动态变化

为了分析禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)对细胞产生的细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影响,并探讨禽呼肠孤病毒的感染机制及病毒与宿主之间的作用关系,运用实时荧光定量RT-PCR技术,测定和分析了ARV-S1133感染CEF细胞后ARV结构蛋白σC和IL-1β、IL-6、TNF-α的动态转录水平。结果显示,ARV-S1133感染CEF后第10小时起病毒σC基因mRNA的相对表达量开始迅速上升,在第48小时达到最高峰(13 162.73倍);ARV-S1133感染后引起CEF中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达量发生变化,这3个基因mRNA的表达变化趋势相似。IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA转录水平在感染早期迅速上升,在感染后第6小时达到第1个峰值,随后下降,在感染中后期再次显著上升,在第48小时达到第2个峰值。IL-1β、IL-6、TNF-α在感染后第6、24、36和48小时的mRNA转录水平与对照组差异极显著(P0.01)。结果表明,ARV感染后可诱导CEF分泌IL-1β、IL-6、TNF-α的水平上调,进而发生炎症反应,说明IL-1β、IL-6、TNF-α可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。     

猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoV M基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×10~8～6.57×10~1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%;灵敏度可达6.57×10~1copies/μL;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0%。上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断。     

SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO、ET-1、P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的影响

为探索肠黏膜微血管内皮细胞在仔猪水肿病发生机制中的作用,将培养的肠黏膜微血管内皮细胞分为对照组、不同浓度SLT-Ⅱe处理组等5个组,采用ELISA法测定了培养3、6、9和12 h时细胞培养上清液中NO、ET-1、P-选凝素、sICAM-1及TNF-α浓度的变化.结果表明,1、10μg/mL SLT-Ⅱe诱导内皮细胞作用12 h时NO的分泌浓度是对照组NO分泌浓度的3倍.1 μg/mL SLT-Ⅱe作用12 h时ET-1、P-选凝素、sICAM-1及TNF-Ⅱ的浓度分别是相应对照组的4.6、2.8、2.8、1.8倍.由此可见,SLT-Ⅱe通过诱导肠黏膜微血管内皮细胞NO、ET-1、P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的过量分泌,NO/ET-1比值下降,引起肠道微循环障碍,炎症反应,导致水肿病的发生.SLT-Ⅱe诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞损伤的最佳模型剂量为1μg/mL.     

断奶仔猪胃肠道乳酸菌及芽孢杆菌的分离鉴定

为研制优良的猪用益生菌制剂,从断奶仔猪胃肠道分离乳酸菌和芽孢杆菌,结合细菌的形态特征、生理生化指标,运用16SrRNA基因序列分析方法对其进行了鉴定。结果表明,分离株WR、KR、HR、JR分别为胃、空肠、回肠、结肠源的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius);ZR株为直肠源的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii);MR株为盲肠源的粪肠球菌(Enterococcus faecalis);分离株WY、SY、KY分别为胃、十二指肠、空肠源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);HY株为回肠源的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cere-us)。各分离株的生长曲线有明显差异,HR、ZR和WY株的生长速度较快,分别于接种后第12、12和20小时达到生长高峰期,显示了良好的培养特性。     

肺泡巨噬细胞在猪链球菌2型引致肺炎过程中的作用

为探明肺巨噬细胞在猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)引致肺炎过程中发挥的作用,用SS2体外感染4周龄SPF巴马小型猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),首先以10倍递增的SS2∶PAM感染比(MOI)分别为1∶10～1 000∶1感染12h;其次以MOI=100∶1分别感染1、2、4、6、12、24h,ELISA检测三种主要炎性细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的质量浓度及动态变化,同时光镜观察PAM的形态变化。结果显示,三种细胞因子具有相似的动态表达趋势,其表达量均随MOI升高和作用时间的延长而上升,与对照组之间均差异极显著(P<0.01),菌液浓度之间和时间点之间均差异显著(P<0.05);同时PAM的形态异常和崩解死亡比例依次增多,表明三种炎性因子的表达量与SS2的浓度和感染时间之间呈正相关;受损或濒死细胞比例亦正相关;提示三种炎性因子由受损细胞或濒死细胞产生。MOI为1∶1感染12h,或MOI为100∶1感染6h的条件下均可致70%的PAM崩解死亡,表明此条件下SS2可摧毁由PAM构筑的第一道防线。三种炎性细胞因子表达最高峰的条件是MOI为100∶1,感染12h,此时镜下细胞几乎全部崩解死亡,表明PAM的完全死亡伴随炎性因子的最大释放,炎症随吞噬功能的完全丧失而开始。结果表明,在SS2引致肺炎过程中,AM的作用是炎症的起始者,而不是抵御细胞。     

重组猪源CD40L体外诱导猪肺泡巨噬细胞IL-1β和TNF-α的分泌

本试验旨在研究重组猪源CD40L蛋白(recombinant porcine CD40L,rpCD40L)的生物学活性。利用Alexa Fluor 488标记rpCD40L后,在体外与CD40+原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)作用,荧光显微镜观察rpCD40L与PAMs的结合,并通过qPCR、ELISA检测作用12 h和24 h后PAMs IL-1β和TNF-αm RNA与蛋白水平的变化。结果显示,荧光标记的rpCD40L与CD40+PAMs作用后,PAMs呈现绿色荧光,rpCD40L与PAMs作用后在基因和蛋白水平促进了IL-1β和TNF-α的表达。结果表明,课题组前期获得的rpCD40L能够与CD40+PAMs结合,且诱导PAMs IL-1β和TNF-α的分泌。     

6-羟多巴胺对小鼠体重及其小肠黏膜结构的影响

采用组织学和图像分析技术,研究了小鼠经腹腔注射交感神经损毁剂6-羟多巴胺后小鼠体重和小肠绒毛长度、V/C比值、绒毛宽度以及黏膜厚度的变化。结果表明,注射6-羟多巴胺组与对照组小鼠相比,体重下降(约3.4%);小肠绒毛变短(5.6%~19.4%),V/C比值减少(0.88%~24.1%),绒毛变窄(8.8%~24.7%)、黏膜厚度变薄(4.4%~16.9%),其中空肠的绒毛长度和黏膜厚度减少较明显,而十二指肠和回肠的V/C比值和绒毛宽度减少较明显。提示交感神经的活动可影响小肠的黏膜结构,从而影响肠道的消化吸收功能。     

犊牛小肠肌间神经丛NOS阳性神经元的发育学变化

用NADPH-黄递酶组织化学方法对1、4和6月龄利杂犊牛小肠肌间神经丛NOS阳性神经元的形态、分布和数量进行了比较研究。结果显示,利杂犊牛小肠肌间神经丛NOS阳性神经元和阳性神经纤维形成清晰的三级网状结构,NOS阳性神经元形态各异,聚集在一起构成大小不等的神经节。小肠各段神经丛中NOS阳性神经元的密度随年龄增长而降低;4月龄到6月龄犊牛空肠肌间神经节的NOS阳性神经元数量变化与十二指肠和回肠相比变化较大;4月龄以空肠的肌间神经丛NOS阳性神经元的核质比(为0.16)最小,回肠与空肠的核质比差异不显著(P>0.05),回肠、空肠与十二指肠的核质比差异显著(P<0.05),6月龄空肠的核质比(为0.25)最大,但小肠各段的核质比相互间差异不显著(P>0.05)。证实,犊牛小肠各段肌间神经丛NOS阳性神经元核质比的发育变化可能与其功能的变化有关。     

豆状囊尾蚴外泌体的分离鉴定及其对家兔免疫应答的调节作用

为探究豆状囊尾蚴外泌体对家兔免疫应答的调节作用,以收集的豆状囊尾蚴分泌排泄产物(ESP)为材料,通过差速离心法分离外泌体,经透射电镜和Western-blot分别对其形态和标志分子进行鉴定。分别用外泌体和ESP免疫家兔,ELISA方法检测家兔血清中特异性抗体和血清细胞因子水平,并通过人工攻虫感染评价其免疫保护效果。结果显示,豆状囊尾蚴外泌体直径为30~150 nm,呈圆形或椭圆形,有完整的脂质双分子层膜结构,且含有外泌体标志蛋白CD63。而且,外泌体免疫组血清特异性抗体、IL-10和IL-4的水平显著升高(P<0.05),而IFN-γ和TNF-α显著降低(P<0.05)或差异不显著。经剖检发现,豆状囊尾蚴ESP免疫组和外泌体免疫组的减虫率分别为65.17%和24.88%。结果表明,外泌体通过上调宿主抑炎因子的表达,诱导宿主产生了Th2型细胞免疫应答,从而有利于囊尾蚴在宿主体内的存活。     

PCV2感染对猪MCP-1和IL-8 mRNA表达的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康普通仔猪,于接种后不同时间宰杀,收集肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照。用竞争PCR技术测定趋化性细胞因子IL-8和 MCP-1 mRNA水平,分析PCV2感染对其mRNA表达的影响。结果显示,与对照组相比,在 PCV2感染后第7 d,IL-8 mRNA水平下降至最低,随后迅速上升,至第14 d时达到高峰,而后快速下降,但仍维持较高水平;MCP-1 mRNA水平在攻毒后第3 d下降至最低,之后逐渐上升,至第14 d时达到高峰,而后下降,第21 d以后恢复正常。结果表明,PCV2感染初期可导致PAM趋化性细胞因子IL-8和MCP-1基因的转录明显下调。