禽流感H9亚型油乳剂灭活疫苗的改进

用新引进的 6株禽流感病毒 (AIV )H9亚型和现制苗用的AIV H9毒株分别制备AIV H9、AIV H5、NDV二联三价油乳剂灭活疫苗 ,免疫 5日龄和 10日龄雏鸡 ,于免疫当日直至 80日龄鸡出栏期间定期采血 ,用HI法检测相应的AIV H9、AIV H5和NDV抗体。结果表明 ,10日龄免疫鸡的AIV H9抗体效价最高 ,5日龄和 10日龄免疫鸡的AIV H5抗体效价差别不明显 ;用引进的 3号AIV H9毒株制备的联苗对 10日龄雏鸡免疫后 2 0d产生AIV H9保护性抗体 ,一直持续到 80日龄以上 ,期间的抗体平均效价为 6 .72 (lb) ,而现制苗用的AIV H9毒株制备的联苗免疫力较差 ;现制苗用的AIV H5毒株制备的联苗免疫效力仍较好 ;分别接种 0 .2 5、0 .30mL/只联苗的雏鸡AIV H5抗体效价没有明显差别 ,而AIV H9抗体效价以接种 0 .30mL/只剂量的为高 ;不同日龄、不同免疫剂量的试验鸡NDV抗体效价没有明显差异。     

H5亚型禽流感病毒HA1基因在Sf9昆虫细胞中的表达及其抗原性检测

利用pBlueBacHis2杆状病毒载体在昆虫细胞Sf9中表达H5亚型禽流感病毒(AIV)的 HA1基因。Western-blotting证明HA1在昆虫细胞中得到了表达,其产物具有抗原性;且不与 H7、H9 AIV的抗血清发生交叉反应,具有良好的特异性。Dot-ELISA结果显示,表达蛋白可以在非变性条件下与相应抗体作用,同样具有良好的抗原性。试验结果证明,表达的H5亚型AIV的 HA1蛋白,为检测禽类体内是否感染H5亚型AIV和监测免疫禽类血清H5抗体水平提供了优良的检测抗原。     

禽流感二价抗原油乳剂灭活疫苗的研制

以禽流感病毒(AIV)H5N4株、H7N3株为抗原研制了H5N4-H7N3二价油乳剂灭活疫苗,并对其物理性状、安全性、免疫效力、保存期及抗体消长规律进行了检测.结果表明,试验鸡疫苗在免疫后3周到9个月内对AIV-H5N4的攻击均获全部保护.疫苗4℃保存15个月,其免疫效力没有下降.     

免疫程序与母源抗体对H5禽流感疫苗免疫鸭和鹅HI抗体水平的影响

对不同日龄与母源抗体水平的鸭和鹅,用H5亚型禽流感疫苗免疫后,其HI抗体消长情况进行了比较和观察,结果,初生水禽3日龄首免即可对禽流感疫苗(H5亚型)产生良好的免疫应答;雏鹅母源抗体几乎以每4d下降1个HI抗体效价单位的速度消退;母源抗体对H5禽流感疫苗免疫后的HI抗体水平存在一定的干扰作用;加强免疫鸭和鹅所产生的H5HI抗体水平及其维持时间与仅免疫一次的鸭和鹅所产生的抗体水平之间存在显著差异;鸭和鹅免疫H5禽流感疫苗后第25~30dH5HI抗体水平达到高峰。     

禽流感病毒NS1抗体间接阻断ELISA检测方法的建立

以禽流感病毒(AIV)重组NS1蛋白作为检测抗原,兔抗NS1血清为阻断抗体,建立了检测AIVNS1抗体的间接阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原的最佳包被浓度为0.6 tμg/mL,阻断抗体的最佳稀释度为1:10 000,待检血清最佳稀释度为1:10.用该方法对42份AIV感染禽类血清样本和50份用AIV灭活疫苗免疫的禽类血清样本进行检测,结果显示,该方法的敏感性为95.2%,特异性为90.0%.交叉反应试验证明,该方法与新城疫等8种其他禽病阳性血清不发生交叉反应.临床检测结果显示,185份AIV灭活疫苗免疫禽血清样本的阴性率为89.2%,20份基因工程疫苗免疫禽血清样本的阴性率为95.0%,42份健康非免疫禽血清样本的阴性率为100%.表明,建立的间接阻断ELISA方法可用于区分AIV自然感染禽和疫苗免疫禽.     

禽流感H9亚型灭活油乳剂疫苗不同剂量的免疫效果比较

将 4 7只 2 8日龄SPF鸡分为 4组 ,第 1～ 3组为试验组 ,每组 12只 ,分别肌肉注射禽流感H9亚型灭活油乳剂疫苗 0 .1、0 .3、0 .5mL/只 ,第 4组 11只为对照组。各组鸡在免疫后 1、2、3周采血 ,测定H9抗体水平 ;在免疫后 3周用 1∶10稀释的AIV H9N2攻毒 ,0 .2mL/只。攻毒后第2、3、4周继续测定H9抗体水平 ,观察了疫苗对鸡的保护效果。结果显示 ,0 .5mL/只剂量的免疫效果比 0 .1mL/只和 0 .3mL/只剂量的免疫效果好 ;攻毒用的AIV H9N2的致病力低 ,对所有试验鸡均不致死。     

亚硒酸钠对禽流感灭活疫苗免疫效果的促进作用

在禽流感病毒 (AIV)H9N2油乳剂灭活疫苗中分别按每头份疫苗加亚硒酸钠 0、0 .0 5、0 .10、0 .2 0、0 .4 0mg ,分别免疫 7日龄AIV疫苗非免疫鸡。免疫后不同时间 ,各含亚硒酸钠疫苗组鸡的HI抗体水平均高于不含硒疫苗组 ,以含亚硒酸钠 0 .2 0mg/头份组鸡的抗体上升快、达高峰值时间早、维持高抗体水平时间长。经对免疫鸡的红细胞免疫花环 (RBC C3bRR)促进率及抑制率测定 ,表明亚硒酸钠能显著提高试验鸡的红细胞免疫花环促进率 ,而红细胞免疫花环抑制率变化各组差异不明显 ,以含亚硒酸钠 0 .2 0mg/头份组的作用最好。     

H7N9亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶单因子血清的制备

为获得特异性H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)单因子血清,根据GenBank中A/Chicken/Zhejiang/SD007/2013毒株的序列人工合成了HA基因和NA基因,然后将其分别克隆至真核表达载体pCAGGS,构建了重组真核表达质粒pCAGGS-HA和pCAGGS-NA,经酶切和测序鉴定后将阳性重组质粒转染COS-7细胞,利用H7N9AIV鸡血清进行Western-blot分析。结果显示,重组质粒中的目的基因均能够成功表达。将重组质粒以每只200μg的剂量免疫4周龄SPF鸡,二免后第14天采集血清并用间接免疫荧光试验和Western-blot检测抗体。结果显示,免疫鸡产生的血清均能与对应质粒经COS-7细胞表达的蛋白发生特异性反应。结果表明,成功制备的H7N9AIV HA蛋白和NA蛋白单因子血清具有良好的反应原性,为提高H7N9AIV的血清学检测方法的准确性提供了一定技术支撑。     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T-HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒(AIV)HA1基因,并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1,与线性化杆状病毒DNA(Bac-N-BlueDNA)共转染sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经3次蚀斑纯化,得到重组杆状病毒rpBlueHisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示,HA1在昆虫细胞中得到表达,且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明,重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明,重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

重组鸡痘病毒首免与灭活疫苗加强免疫对高致病性禽流感免疫效果的影响

用表达H5亚型禽流感病毒(AIV)HA与NA基因的重组鸡痘病毒(rFPV)rFPV-12LSH5NA对10日龄带有H5亚型AIV母源抗体的商品鸡进行了首次免疫,17日龄时再用H5亚型AIV全病毒灭活疫苗加强免疫.免疫鸡分为2个批次,分别在24和31日龄用H5亚型AIV进行致死性攻击.在24日龄攻毒组中,rFPV首免与全病毒灭活疫苗加强免疫组的死亡比例(0/17)显著低于17日龄全病毒灭活疫苗单独免疫组(16/17).在31日龄攻毒组中,rFPV首免与全病毒灭活疫苗加强免疫组的死亡比例(0/17)显著低于10日龄rFPV单独免疫组(6/17).结果显示,在鸡群普遍存在针对H5亚型AIV母源抗体的情况下,rFPV首免与全病毒灭活疫苗配合使用能使鸡体快速建立坚强的免疫保护反应,是一种非常有效的免疫策略.     

鸭源H9N2亚型流感病毒NS基因的克隆及表达

根据GenBank中收录的H9N2亚型流感病毒的NS基因序列设计合成了 1对引物NSU/NSL ,利用RT PCR扩增出了H9N2株NS基因 ;将该基因片段克隆到 pMD 18 T载体上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果 ,获得了NS基因片段的阳性重组子 ,扩增的NS基因包含NS1基因完整的阅读框架和部分NS2基因 ,其序列与GenBank中收录的其他分离株NS基因比较 ,同源性达 96 %～ 99%。再将克隆的NS基因插入到原核表达载体 pET 2 8a后 ,转化E .coliBL2 1(DE3)感受态细胞 ,在IPTG诱导下获得了预期的蛋白表达 ,所表达蛋白质的分子质量约为 30ku。     

H5N1禽流感病毒感染雏鸭的病理学观察

通过眼观病变观察和组织病理学检查方法对H5N1禽流感病毒感染雏鸭的各器官组织病理变化进行了系统的研究,为H5N1禽流感病毒致病机制的研究及禽流感的-临床诊断提供理论依据.结果显示,雏鸭感染H5N1禽流感病毒后,除机体出现临床症状外,主要呈现明显的神经症状;病理剖检发现胰腺、肝、脾肿大,并见大小不一、数量不等的坏死灶;组织病理学检查发现全身各器官组织呈现出血、坏死和淋巴细胞浸润.经分析,多器官发生明显的细胞变性、坏死很可能是H5NI亚型禽流感病毒致病性的重要表现形式之一.     

禽流感病毒H7亚型血凝素基因的原核表达及鉴定

参考已发表的禽流感病毒 (AIV)H7亚型血凝素 (HA)基因序列设计引物 ,经RT PCR扩增了AIV H7亚型的HA1基因片段 ,再将该片段定向插入到原核表达载体 pGEX 4T 2中 ,转化大肠埃希氏菌。重组表达载体经酶切和测序鉴定后 ,用IPTG诱导表达。用Western blotting和ELISA试验鉴定表达产物的抗原性。结果表明 ,融合表达蛋白能与AIVH7N1、H7N2、H7N7和H1N1亚型标准抗血清反应 ,而与H5N1、H9N 2等其他 13个亚型的抗血清无交叉反应。     

H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)M基因和HA基因序列设计了3对引物,其中1对为针对不同HA亚型AIV的通用引物,另外2对为分别针对AIVH5和H7亚型的特异性引物。这些引物所扩增的cDNA片段大小分别为244、860和634bp。利用这3对引物,通过对多重RTPCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别AIVH5、H7亚型的多重RTPCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术对AIVH5亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段;对AIVH7亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段;对AIVH5和H7亚型混合样品能同时扩增出3条大小分别为244、860和634bp的cDNA片段;对其他AIVHA亚型只扩增出1条244bp的cDNA片段;对其他常见禽病病原扩增均为阴性;该多重RTPCR对AIVRNA、AIVH5和AIVH7亚型RNA的最低检出量分别为10、100和100pg。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达

利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析。结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B。再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1。经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21(DE3)(pLysS)感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白。用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性。     

H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对H9亚型禽流感病毒(AIV)不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×104.7EID50/mL;阳性棉拭子的最低检出量为1×102.5EID50/mL。用该方法检测H1~H15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,结果仅有H9亚型AIV出现特异性目的条带,而其他均未出现目的条带。脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品在1∶10稀释度下,病毒分离和RT-PCR方法可以达到相同的阳性检出率。表明建立的AIV H9亚型RT-PCR方法具有较好的特异性和敏感性。     

动物园野生禽类禽流感H5亚型灭活油乳剂疫苗的应用

自 2 0 0 3年 12月以来 ,东南亚国家接连发生了高致病性禽流感 ,我国部分省、市也相继发生了高致病禽流感疫情。 2 0 0 4年 1月 2 3日深圳市野生动物园饲养的 1～ 2岁黑天鹅突然死亡 8只 ,2 4日又死亡 12只 ;其后 ,成年的黑天鹅也相继出现病情 ,到 2月 5日 ,共死亡黑天鹅 6 9只。经对死亡黑天鹅剖检及取样送检 ,被确诊感染禽流感H5亚型病毒。在黑天鹅出现不寻常死亡后 ,深圳市野生动物园对园内现存的 6 84 6只禽紧急注射了禽流感H5亚型灭活油乳剂疫苗。为了探讨该疫苗对国内动物园水禽类、雉鸡类、鹳类及其他鸟类的免疫方法 ,笔者在深圳市…     

H7N2禽流感病毒分离株血凝素蛋白全基因的序列分析

为进一步分析H7N2禽流感病毒(AIV)分离株血凝素(HA)基因的特性,参照已发表序列设计了1对引物,采用RT-PCR获得了1条约1.7 kb的DNA片段,测序后进行了同源性比较、HA基因系统发育进化树分析和氨基酸编码分析。结果表明,所测的2个分离株的HA基因全长1 664 bp,编码除信号肽以外的HA蛋白的全部544个氨基酸,其中包括HA1的323个氨基酸,HA2的221个氨基酸。2个分离株HA基因核苷酸序列的同源性为99.4%;与GenBank中AIV标准株A/Afri.Star./Eng-Q/983/79(H7N1)的同源性最高,分别为99.4%和99.0%;与美国A/Chicken/NewYork/13142-5/94(H7N2)株同源性很低(仅65.0%),而与以色列、意大利H7N2AIV的同源性较高(为96%~97%);2个分离株在HA基因进化树中均处于H7亚型AIV的欧亚群系分支内。推导氨基酸的序列分析表明,其HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为-GR-GLF-,仅包含1个碱性氨基酸(R-)残基,符合低致病力AIV的基因特征。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-T-HA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的 HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。     

H9N2亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及其序列特征

用RT PCR技术扩增到H9N2亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Shanghai/F/ 98(简称F株 )的核蛋白 (NP)全基因。 18个毒株NP基因核苷酸序列比较结果显示 ,以Q/HK/G1/ 97为代表的、并和同期香港发生的人流感事件有直接联系的毒株相互间同源率达 98.3%～ 99.3% ,而F株与它们的同源率为 92 .2 %～ 92 .8%。遗传进化分析结果表明 ,F株独成一组 ,可暂时划分到类C/Ko/ 32 3/ 96亚系。从目前已发表的H9N2毒株NP基因数据不能确定F株的来源