SDS┐PAGE和免疫印迹技术对绵羊肺炎霉形体和丝状霉形体山羊亚种膜蛋白的分析

ＳＤＳ┐ＰＡＧＥ和免疫印迹技术对绵羊肺炎霉形体和丝状霉形体山羊亚种膜蛋白的分析１）逯忠新邓光明包慧芳梁桂香（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）绵羊肺炎霉形体（ｙ－９８，下同）和丝状霉形体山羊亚种（ＰＧ３，下同），都能引起山羊传染性胸膜肺炎，两...     

贵州省部分地区山羊传染性胸膜肺炎血清学调查

山羊传染性胸膜肺炎是由丝状霉形体山羊亚种引起的一种高度接触性传染病 ,病羊以体温升高、流鼻液、咳嗽、呼吸困难消瘦为主要特征。我国最早于 193 5年在内蒙古发现本病 ,后在甘肃、四川等地也发现本病。截至 1998年 ,贵州省尚未开展过山羊传染性胸膜肺炎的调查。为弄清本病在贵州省的流行情况 ,笔者对全省 9个地 (州、市 )的养羊专业户及羊场进行了山羊传染性胸膜肺炎血清学调查1　材料与方法1.1　材料　从全省 9个地 (州、市 )、42个乡镇的养羊户和羊场随机抽样 ,采血 63 0头份 ,分离血清 ,置 -2 0℃冰箱保存 ,于 10ｄ内用微量间接血凝检…     

牛霉形体PCR检测方法的建立

参考GenBank中牛霉形体和无乳霉形体P81基因的序列差异,设计了针对牛霉形体P81基因的PCR引物,建立了牛霉形体PCR检测方法.并对该方法进行了敏感性和特异性试验.该方法可以从100ccu/mL(ccu:color change unit,颜色变化单位)的牛霉形体培养物中检出目的片段;经对丝状霉形体丝状亚种SC型(MmmSC)PG1株、丝状霉形体丝状亚种LC型(MmmLC)Y-goat株、山羊霉形体山羊亚种(Mccp)87001株、无乳霉形体(M.agalactiae)PG2株、绵羊肺炎霉形体Y-98株等亲缘关系相近的霉形体纯培养物检测,结果证实该方法具有良好的特异性.利用建立的PCR检测方法可以从人工感染牛的鼻拭子和临床发病牛肺中扩增出目的片段,与分离培养结果完全符合,本方法为国内首次建立的敏感、特异、快速的牛霉形体PCR检测方法.     

山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白的免疫原性

通过免疫印迹试验对山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白及M1601株全菌蛋白进行了免疫原性分析,并与绵羊肺炎支原体抗血清和丝状支原体山羊亚种抗血清进行了比较,以筛选M1601株特异性的外膜蛋白。结果表明,存在于外膜蛋白中的分子质量分别为60.0和49.7 ku的蛋白是其主要的免疫原性蛋白,也是山羊支原体山羊肺炎亚种区别于丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体的主要特异性抗原,这一结论为山羊传染性胸膜肺炎的诊断和疫苗研制奠定了良好的理论基础。     

山羊传染性胸膜肺炎的诊断与防治

山羊传染性胸膜肺炎是由丝状霉形体山羊亚种引起的山羊特有的急性或慢性接触性传染病 ,临床特征是高热、咳嗽 ,肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症。近几年江西省随着畜牧业结构的调整 ,山羊养殖得到了迅速发展。但山羊的疫病随之也增多 ,尤其山羊传染性胸膜肺炎的发病率更高 ,已成为危害当地山羊生产的主要疫病。1　流行特点笔者诊治的发病羊包括目前江西省饲养的成都麻羊、南江黄羊、波尔山羊、贵州黑山羊和本地山羊 ,表明不同品种的山羊都能感染本病。成年山羊和幼龄山羊都可感染发病 ,尤其 3岁以下的山羊最易感染 ,但有些发病羊群成年山…     

集约化羊场山羊传染性胸膜肺炎的诊治

集约化羊场山羊传染性胸膜肺炎的诊治楼伯章（浙江省临海市农业局畜牧兽医站３１７０００）山羊传染性胸膜肺炎是一种由山羊丝状霉形体引起的接触性传染病，以高热、咳嗽、肺胸病变为特征，传播迅速，死亡率高，对规模养羊的威胁尤为严重。近年我市的海岛羊场（以下称Ｄ场...     

牛传染性胸膜肺炎的血清学诊断

(一)诊断牛传染性胸膜肺炎,是以综合分析的结果作为依据(临床一流行病学、病理剖检、细菌学、血清学)。综合诊断的难点主要在于病原体分离培养比较困难,缺乏特征性临床症状。通过培养分离细菌学的方法至少要经过30～45天方能作出诊断。分离传染性胸膜肺炎病原有一系列困难,病原体丝状霉形体丝状亚科(Mycopla-sma mycoides Var.mycoides)特别“挑剔”,生长缓慢并在病原体鉴别过程中常常需要补充继代移植。     

霉形体检测技术简介

霉形体 (Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ)是一类缺乏细胞壁的原核生物 ,最早分离自牛传染性胸膜肺炎病例 ,初称之为胸膜肺炎微生物 (ＰＰＬＯｓ)。在分类学上 ,霉形体属于原核生物界、软壁菌门、软膜体纲、霉形体目、霉形体科、霉形体属 ,在医学和兽医学上是一类重要的病原微生物 ,对人类及猪、牛、禽和试验动物等有广泛的致病性 ,主要侵害呼吸道和生殖道 ,还有关节、乳腺、眼部。霉形体个体微小 ,结构简单 ,无细胞壁 ,呈多形性形态 ,因而可通过细胞滤器。霉形体还常污染用于生产生物制剂的细胞或鸡胚 ,导致生物制剂品质下降或废弃 ,因此霉形体的检测…     

丝状霉形体山羊亚种巢式PCR检测方法的建立

根据已发表的丝状霉形体簇各成员核苷酸序列,设计合成了2对引物McF、McR和MmcF、MmcR,建立了可以鉴别丝状霉形体山羊亚种(Mycoplasma mycoidessubsp.capri,Mmc)的巢式PCR方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法只能对Mmc扩增出195 bp的片段,而对其他病原菌不能扩增出任何条带,它最低能够检测出10 pg的Mmc DNA,说明该方法具有良好的特异性和很高的敏感性。田间试验结果显示,对4株霉形体分离株及其病料均可扩增出Mmc特异性片段,表明,该巢式PCR方法可用于Mmc快速鉴定和流行病学调查。     

丝状霉形体山羊亚种血清抗体间接ELISA检测方法的建立

利用丝状霉形体山羊亚种标准株PG3制备抗原,经纯化后作为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于检测丝状霉形体山羊亚种血清抗体。经方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为1.09μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物的最佳稀释度为1∶40 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h。判定标准为样品D490 nm值与标准阴性血清D490 nm值之比(P/N)≥3为阳性,≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑。重复性和稳定性试验证明,建立的间接ELISA的稳定性和重复性良好,与间接血凝试验相比,其敏感性较高。     

羊肺炎霉形体细胞蛋白多肽分析

羊肺炎霉形体细胞蛋白多肽分析包惠芳邓光明逯忠新梁桂香（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）羊肺炎霉形体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）自Ｍａｃｋｅｙ等（１９６３）和Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ等（１９７９）先后从患胸膜肺炎的绵羊和山羊...     

猪霉形体病的监控与预警预报

猪霉形体病(Mycoplasmalpneumoniaofswine ,MPS)是由猪肺炎霉形体(Mycoplasmahyopneumo niae)引起的慢性接触性呼吸道传染病[1] ,对养猪业危害极大。笔者试图从病原学、流行病学、临床症状、病理变化等方面对该病的监控和预警预报作一概述。1　病原学关于猪霉形体病的病原,早期有人认为是细菌,以后又有人认为是病毒,直到196 5年,美国的Mare等和英国的Goodwin等在无细胞的人工培养基中培养成功,证实其病原是霉形体,并将该病命名为猪霉形体病或霉形体肺炎。1973年,我国学者也从发病猪体分离到该病原。1.1　猪肺炎霉形体的形态特征猪肺炎霉…     

羊肺炎霉形体病调查

1992年在西北某地区的3个县10个牧场,对2160余只羊进行了羊肺炎霉形体病的调查,血清样品673份,检出阳性101份,阳性率为16％;并从发病地区羊群采集的2例山羊和1份鼻拭子病料中分离到3株霉形体。经系统鉴定和人工感染试验确诊为羊肺炎霉形体(M.ovipneumonia)。     

霉形体及霉形体病研究进展

霉形体 (Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ)是软皮体纲 (Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ)霉形体目(Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ)中的一类原核微生物[1] 。霉形体及霉形体病的研究 ,始于 1898年Ｎｏｃａｒｄ从牛传染性胸膜肺炎病灶中分离出该种病原体 ,至今已愈百年 ,但早期由于诸多因素 ,这方面的研究进展缓慢。 1962年Ｃｈａｎｏｃｋ及Ｈａｙｆｌｉｃｋ在人工培养基上分离肺炎霉形体获成功后 ,霉形体的研究得以迅速发展。资料报道 ,截至 2 0 0 0年分离出的霉形体达 160种 ,遍布世界各地[2 ,3 ] ,对人类及牛、羊、猪、鸡等的危害较大。同时实验动物及细胞培…     

山羊支原体山羊肺炎亚种特异性分子检测靶标的鉴定和应用

本文旨在筛选出新的山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)特异性分子诊断靶标。首先通过全基因组本地BLASTp方法筛选得到Mccp理论上特异的蛋白基因序列,经BLASTn验证、优选特异性基因92.1作为候选靶标,设计引物92.1F/R,采用普通PCR体系检测4株Mccp(1801、1601、1309F、Zly-14)和7种其他支原体基因组DNA,包括无乳支原体(Ma)PG2、丝状支原体山羊亚种(Mmc)PG3、Mmc YG(前称丝状支原体丝状亚种大菌落型,MmmLC)、绵羊肺炎支原体(Mo)Y98、山羊支原体山羊亚种(Mcc)Ckid、牛支原体(Mb)08M、李奇氏支原体(Ml)PG50,并检测Mccp、Mo、Mmc人工感染羊试验样本DNA,评估该体系的特异性。结果表明92.1F/R引物只能从Mccp菌株及其感染试验样本中扩增出509 bp目的条带,证实该引物可用于检测Mccp,92.1序列可作为CCPP新的核酸诊断靶标,为CCPP诊断和实验室研究提供了一种新的分子标记。     

类山羊传染性胸膜肺炎诊断和防治的研究——病原诊断

于1987年从甘肃省陇东类山羊传染性胸膜肺炎流行区采取临床可疑的山羊、绵羊病料,进行了一系列病原诊断研究,结果:排除了相关致病因素,如梅迪,维士那,山羊关节炎脑炎(CAE),衣原体及相关致病菌感染和寄生虫侵袭;最终从21例山羊6/6例绵羊病变肺组织中培养分离出支原体13株/4株,分菌率均在60％以上,分离株经初步鉴定后,经英国国际支原体鉴定中心(NCTC)最终鉴定均为绵羊肺炎支原体(M.ovipneumonia);以分离株人工感染健康山羊7只,绵羊3只,结果6/7的山羊,2/3的绵羊于接种后第14天始形成与自然病例相似的病变,并以7/7山羊,2/3绵羊病变肺组织中收回原接种物;以琼脂双扩散,试管凝集反应及间接血球凝集试验进行抗原性研究结果证明,分离株与绵羊肺炎支原体标准株(y—98)具有共同抗原性。从而不仅首次确证了该地本病是由绵羊肺炎支原体所致,且对山羊和绵羊都具有很高的感染率和较强的致病性。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌 (APP)外膜脂蛋白基因序列 ,设计合成了 1对特异性引物。经PCR扩增 ,APP 110标准血清型菌株均能扩增出大小为 980bp的DNA片段 ,而大肠埃希氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎霉形体和葡萄球菌等的扩增结果均为阴性。该方法检测APPDNA的敏感性可达 2pg。表明 ,此PCR方法特异性好 ,敏感性高 ,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断。     

牛霉形体免疫相关性蛋白P51的筛选与鉴定

为了筛选免疫原性蛋白,建立牛霉形体的快速诊断方法,利用二维凝胶(2-D)电泳、Western-blot分析及蛋白质谱分析,筛选出一个免疫相关性蛋白P51。以牛霉形体中国分离株Hubei-1为模板,扩增了p51基因,并克隆到原核表达载体pET32a上。结果显示,重组蛋白pET32a-p51与牛霉形体阳性血清的Dot-blotting试验结果为阳性,而Western-blotting试验结果为阴性。以pET32a-p51重组蛋白为包被抗原的ELISA试验表明其能与自然感染和人工感染牛霉形体的阳性血清发生特异性反应,而与灭活疫苗免疫的阳性血清不发生特异性反应,与牛传染性胸膜肺炎的阳性血清没有交叉反应。表明P51可能是牛霉形体特有的一种构象依赖性免疫相关蛋白,是一种有前景的诊断用抗原。     

山羊支原体山羊肺炎亚种特异性分子检测靶标的鉴定和应用

本文旨在筛选出新的山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, Mccp）特异性分子诊断靶标。首先通过全基因组本地BLASTp方法筛选得到Mccp理论上特异的蛋白基因序列，经BLASTn验证、优选特异性基因92.1作为候选靶标，设计引物92.1F/R，采用普通PCR体系检测4株Mccp（1801、1601、1309F、Zly-14）和7种其他支原体基因组DNA，包括无乳支原体（Ma）PG2、丝状支原体山羊亚种（Mmc）PG3、Mmc YG（前称丝状支原体丝状亚种大菌落型，MmmLC）、绵羊肺炎支原体（Mo）Y98、山羊支原体山羊亚种（Mcc）Ckid、牛支原体（Mb）08M、李奇氏支原体（Ml）PG50，并检测Mccp、Mo、Mmc人工感染羊试验样本DNA，评估该体系的特异性。结果表明92.1F/R引物只能从Mccp菌株及其感染试验样本中扩增出509 bp目的条带，证实该引物可用于检测Mccp，92.1序列可作为CCPP新的核酸诊断靶标，为CCPP诊断和实验室研究提供了一种新的分子标记。     

丝状霉形体丝状亚种SC型脂蛋白LppQ基因的序列分析

根据基因库发表的丝状霉形体丝状亚种SC型 (MmmSC)脂蛋白LppQ基因序列设计引物 ,采用PCR对国内MmmSC分离株HVRI X株的脂蛋白LppQ基因进行扩增 ,将扩增产物与pMD18 T载体连接并测序。核苷酸序列比较结果显示 ,HVRI X株的LppQ基因序列与基因库发表的核苷酸序列同源性为 99.8% ;由其推导的氨基酸序列同源性为 99.3%。