抗菌肽Dermadistinctin-K的原核表达及生物活性鉴定

为了获得抗菌肽Dermadistinctin-K并鉴定其生物活性,依据GenBank中的氨基酸序列,使用化学合成和PCR相结合的方法获得了完整的Dermadistinctin-K基因序列;使用表达载体pET-32a(+)构建工程菌;用IPTG诱导融合蛋白表达并优化其表达条件,在IPTG终浓度0.1mmol/L下诱导5h表达量最大;最后用His-tag protein Purification kit纯化了融合蛋白,使用肠激酶酶切获得目的蛋白,并进行生物活性鉴定。分析结果表明,抗菌肽Dermadistinctin-K具有抗菌活性和一定的耐热性,其生物活性与pH值密切相关。     

西尼罗病毒E蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用PCR技术扩增西尼罗病毒(WNV)E蛋白基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-WNV-E,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对诱导条件进行优化,利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE与Westernblot鉴定正确后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示:WNV E蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式被成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体能特异性识别WNV E蛋白。本研究成功表达并纯化了WNV E蛋白,证明该蛋白具有良好的免疫原性,为WNV抗原、抗体检测方法的建立和新型疫苗的研发及相关研究奠定了基础。     

水牛cMyc基因与穿膜肽TAT的融合表达

为探讨干细胞转录因子与穿膜肽融合表达蛋白对水牛体细胞诱导重编程的可行性,作者对影响水牛cMyc基因穿膜肽融合蛋白表达的因素进行了探索。应用双酶切定向克隆的方法,将水牛cMyc基因CDS(1 350bp)连接到pET-HA2-TAT载体中,构建成pET-cMyc-TAT载体,经酶切、PCR和测序验证,载体构建正确。将pET-cMyc-TAT载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导目的蛋白表达,同时探索了其表达形式、诱导表达IPTG最优浓度和最优时间以及蛋白纯化咪唑洗脱的最佳浓度。结果表明,融合蛋白cMyc-TAT在37℃以包涵体的形式大量表达,IPTG终浓度0.001mmol/L,诱导5h为最佳诱导条件,纯化蛋白最佳咪唑洗脱浓度为145.76mmol/L,纯化蛋白经过Western-blot验证具有抗原性。研究结果为建立转录因子穿膜肽融合蛋白诱导水牛iPS细胞技术体系奠定了基础。     

高铜对肉鸡心肌细胞线粒体自噬的影响

为了探究高铜(copper,Cu)是否能诱导肉鸡心肌细胞线粒体发生自噬,本研究选用48只1日龄健康白羽肉鸡,随机将其分为4组,每组12只,分别喂以对照日粮(11 mg/kg Cu,对照组)和高铜日粮(110mg/kg Cu,高铜I组;220 mg/kg Cu,高铜Ⅱ组;330 mg/kg Cu,高铜Ⅲ组),并于49日龄进行心脏采集,实时荧光定量PCR检测肉鸡心肌细胞中线粒体自噬相关基因PIN K 1、Parkin、LC3-I、LC3-Ⅱ、p62和NIX的mRNA转录水平,免疫印迹和免疫组织化学技术分别检测蛋白LC3-Ⅱ/LC3-I的表达与LC3-Ⅱ的定位。结果显示,高铜可显著上调线粒体自噬相关基因PINK1、Parkin、LC3-I、LC3-Ⅱ和NIX的mRNA转录水平(P0.05),但p62的mRNA转录水平变化不显著(P0.05),蛋白LC3-Ⅱ/LC3-I也显著升高(P0.05),且由免疫组织化学结果可看出肉鸡心肌细胞中LC3-Ⅱ的棕色阳性颗粒增加(P0.05)。上述结果表明,高铜可诱导肉鸡心肌细胞线粒体发生自噬。     

水牛IFN-γ成熟蛋白基因的原核表达及其产物多克隆抗体的制备

将水牛γ-干扰素成熟蛋白(IFN-γ)基因亚克隆至pGEX-6P-1中,成功构建了pGEX-BoIFN-γ表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)重组菌进行IPTG诱导表达。应用SDS-PAGE方法对表达产物rGST-BoIFN-γ进行分析,用GST琼脂糖凝胶柱对可溶性蛋白进行分离纯化,并采用ELISA和Western-blot试验鉴定重组蛋白的免疫活性。将可溶性纯化蛋白作为抗原免疫小鼠,包涵体蛋白经SDS-PAGE分析后切取目的蛋白免疫小鼠以制备多克隆抗体。结果表明:重组菌经37℃0.5 mmol/L的IPTG诱导3 h,表达出43 ku的融合蛋白。目的蛋白的表达量达到菌体总蛋白量的30%,分别以可溶性和包涵体两种形式存在,而可溶性表达蛋白纯化后的纯度较高。获得的重组蛋白具有良好的免疫活性。均能从可溶性蛋白及包涵体蛋白免疫小鼠得到针对rGST-BoIFN-γ的特异性多克隆抗体。     

脑心肌炎病毒VP1结构蛋白的可溶性表达及鉴定

为获得可溶性表达的脑心肌炎病毒(EMCV)结构蛋白VP1片段,将EMCV VP1基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中。采用不同温度、不同IPTG浓度及不同诱导时间诱导目的蛋白表达,以筛选VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件,并通过Western-blotting检测最佳条件下表达蛋白的免疫活性。PCR、酶切鉴定及测序结果表明,VP1基因已克隆入pGEX-4T-1质粒。经优化,确定VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当D600nm值为0.4～0.6时,以0.25mmol/L IPTG于25℃条件下诱导表达12h。Western-blotting结果显示,诱导表达的蛋白具有免疫活性。     

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒(NDV)强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V 基因全长cDNA,并引进相应的突变位点,将其克隆到pMD18-T载体,然后亚克隆到原核表达载体 pET-30c上,重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,筛选出阳性重组质粒,并命名为pET-30c-V。将 pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol／L IPTG 37℃过夜诱导表达,SDS-PAGE 及Western-blotting分析结果表明,所表达的NDV V重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子质量约28 ku,与理论值大小相符。将包涵体用8 mol／L脲变性,经Ni-NTA柱纯化,透析复性,得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡(300 μg／只),成功制备了抗鸡NDV V蛋白的抗血清。     

基于ORF3蛋白的PCV2间接ELISA诊断方法的建立

ORF3蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type,2PCV2)的一个重要的非结构蛋白。根据GenBank数据库中PCV2的ORF3基因序列设计引物,以PCV2基因组为模板进行PCR扩增,并构建重组表达质粒。将重组质粒转染至BL21感受态细胞,进行最佳诱导条件的选择,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化表达产物。以纯化后的重组ORF3蛋白作为酶标包被抗原,优化反应条件,建立PCV2间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)诊断方法。结果显示,重组质粒经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定构建成功。重组蛋白表达的最佳诱导条件为37℃、8 h、1 mmol/LIPTG。Western-blot结果表明,该重组蛋白具有较好的免疫原性。Ni-NTA亲和层析纯化结果表明,280 mmol/L咪唑为最佳洗脱浓度。iELISA的最佳包被抗原质量浓度为0.03 mg/m L,待检血清最佳稀释度为1∶100,酶标抗体最佳工作浓度为1∶4 000。批内和批间试验结果表明,该方法具有较好的重复性。此iELISA与PCR检测方法具有良好的一致性。结果表明,基于ORF3蛋白建立的PCV2间接ELISA诊断方法,可以为临床上rCap蛋白基因工程疫苗免疫猪场进行鉴别诊断。     

牛胸腺素原α基因的原核表达与分析鉴定

为了把牛胸腺素原α(ProTα)开发为免疫增强剂,从重组克隆载体pMD18-T-ProTα上扩增ProTα基因,分别构建和筛选出了pGEX-4T-1-ProTα、pET-30a(+)-ProTα的BL21、BL21codon plus和Rosetta Blue(DE3)plys重组原核表达菌株,采用不同的条件组合对其进行诱导表达。结果,重组菌BL21codon plus-pET-30a(+)-ProTα表达出约24ku和30ku两个蛋白条带,且在37℃、IPTG浓度为0.5mmol/L、诱导3h时表达量最大,重组蛋白主要以可溶性形式存在;而pGEX-4T-1-ProTα重组菌在诸多条件下都未表达出目的蛋白。纯化产物的Western-blot分析显示,重组蛋白可与兔抗人ProTα多抗发生特异性免疫反应,表明重组蛋白具有免疫学活性结构。研究结果为重组ProTα蛋白的结构与功能研究奠定了基础。     

多杀性巴氏杆菌HN06株磷酸甘油酸变位酶gpmA基因的序列分析及其原核表达

为探索糖酵解关键酶磷酸甘油酸变位酶的功能,采用PCR方法从多杀性巴氏杆菌HN06株中扩增出了磷酸甘油酸变位酶基因gpmA,将其克隆到表达载体pET-30a(+)中,测序验证后转入表达菌株大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。结果显示,重组菌可表达出分子质量约为32ku的重组融合蛋白,在终浓度为20mmol/L IPTG诱导3h的情况下表达良好。表达的蛋白以可溶性蛋白的形式存在于菌体中。表达产物经Ni柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经过Western-blot分析,所纯化的蛋白能与抗多杀性巴氏杆菌HN06株阳性血清进行特异性的免疫印迹反应,证实表达的蛋白具有良好的反应原性。     

湖北省禽白血病自然病例的病理学诊断及p53和Bcl-2基因表达情况的观察

应用组织病理学和SABC免疫组织化学技术,对湖北省武汉市的2批14日龄和33日龄疑似禽白血病肉鸡进行了病理学诊断,并观察了病鸡肝肿瘤组织中p53基因和Bcl-2基因的表达情况。剖检可见病鸡肝、肾、脾均不同程度肿胀,组织病理学检查在肝、肾、心等脏器可见散在或聚集成团的骨髓瘤细胞,胞浆内充满球形的嗜酸性颗粒;在病鸡肝肿瘤组织中p53和Bcl-2基因均呈阳性表达,诊断为J亚群禽白血病(ALV-J),提示p53基因和Bcl-2基因与肉鸡J亚群禽白血病有关。     

猪瘟病毒P7基因的原核表达及表达产物的寡聚化研究

采用RT-PCR方法从接种了猪瘟疫苗的家兔脾组织中扩增出了P7基因,将其克隆到表达载体pSMK中,测序验证后转化入表达菌BL21中进行诱导表达。结果显示,重组菌可以表达出分子质量约为19ku的重组融合蛋白,经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导2h的表达效果较好。表达产物经Ni柱纯化,可得到纯度较好的目的蛋白。纯化的蛋白置于4℃2d后进行Western-blot检测,发现有多聚体形成;戊二醛交联结果表明,P7蛋白可形成同源寡聚体。此研究结果为进一步研究猪瘟病毒P7基因表达蛋白的性质和功能奠定了基础。     

猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3.1-pIL-18为模板,采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18(IL-18)的成熟蛋白基因,通过KpnⅠ SacⅠ双酶切及连接反应,构建了pET32c-pIL-18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中的基因片段连接正确。之后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS-PAGE分析,在分子质量约为33 ku处出现了预期的目的蛋白。用8 mol/L脲对表达产物变性,经Ni2 -NTA柱纯化,透析复性,得到了纯化的IL-18蛋白。Western-blot分析证实,纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。     

高铜诱导肉鸡肌胃和腺胃发生自噬与凋亡

为了探讨高铜对肉鸡肌胃和腺胃发生自噬与凋亡的影响，本试验选用240羽1日龄AA白羽肉鸡作为试验动物，并随机分为4组，分别饲喂含铜11 mg/kg（对照组）、110 mg/kg（高铜I组）、220 mg/kg（高铜II组）和330 mg/kg（高铜III组）的日粮，并于49日龄采集肌胃和腺胃，制作组织切片观察组织学变化，采用实时荧光定量PCR检测自噬和凋亡相关基因的mRNA表达，免疫印迹检测LC3-II/LC3-I和Caspase3的蛋白表达。结果显示，高铜可引起肌胃中肌纤维稀疏，腺胃中的腺细胞发生脱落以及空泡变性。另外，高铜可显著上调肌胃和腺胃中自噬相关基因Beclin1、Atg5、LC3-I、LC3-II和凋亡相关基因Bax、Bak1、p53、Cyt C和Caspase3的表达，LC3-II/LC3-I和Caspase3的蛋白表达水平也显著升高，而mTOR和Bcl2的mRNA转录水平则显著下调。此外，腺胃和肌胃中p62的mRNA转录水平呈现先降低后升高的趋势。结果表明，高铜可诱导肉鸡的肌胃和腺胃发生自噬和凋亡。     

猪源札幌病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性检测

为获得猪源札幌病毒(SaV)衣壳蛋白(VP1),以SaV CH430株的RNA为模板,采用RT-PCR扩增VP1基因;将其克隆到原核表达载体pET-30a中,并将成功构建的原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果显示,获得的VP1基因全长为1 635bp,编码545个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,目的条带大小为63ku,与预期结果相符。重组菌在37℃、IPTG终浓度为0.8mmol/L、诱导表达6h时重组蛋白的表达量达到最大值,表达的目的蛋白主要以包涵体的形式存在。将纯化的VP1重组蛋白免疫家兔,得到了超免疫血清。Western-blot分析表明,该重组蛋白与超免疫血清具有良好的反应原性。上述试验结果为深入研究VP1蛋白的功能和研制ELISA诊断试剂盒奠定了基础。     

牛碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的生物学活性

采用巢式PCR方法克隆了牛18ku-bFGF基因完整的编码序列,并构建了原核表达载体pET-28a-bFGF,将其转化大肠杆菌BL21,在25℃低温条件下,用0.5 mmol/L IPTG诱导表达5 h,用Ni-NTA亲和纯化细胞裂解上清液,经Western-blotting检测,结果显示,在特定的诱导条件下,重组牛bFGF基因在大肠杆菌中获得了表达,并且主要以可溶性状态存在于细胞中。经检测,纯化后的重组蛋白能显著促进成纤维细胞的增殖(P<0.05),其活性与商品用重组人18ku-bFGF没有差异(P>0.05)。表明,所获得的可溶性重组牛18ku-bFGF蛋白具有较高的生物学活性,可用于后续研究工作。     

柔嫩艾美球虫扬州株SO7抗原基因表达条件的研究

通过RT-PCR扩增柔嫩艾美球虫YZ株折光体SO7抗原基因,并进行克隆和测序。将不含信号肽编码区片段的SO7基因克隆入表达载体pGEX-6p-1谷胱甘肽-S-转移酶基因的下游,构建表达质粒pGEX-6p-1-SO7,转化宿主菌BL21,获得重组菌。通过建立生长曲线,对诱导条件的摸索,根据SDS-PAGE确定融合蛋白的最佳表达条件。通过融合蛋白切胶免疫小鼠制备超免疫血清,经间接ELISA检测其与E.tenella子孢子抗原反应的特异性。结果显示,诱导时机和诱导时间是影响表达的主要因素,诱导温度、IPTG浓度次之;诱导时机以3 h为最佳,诱导时间以4.5 h为最佳;诱导温度以37℃最佳,0.008~1.000mmol/L的IPTG对表达量的影响不大。在优化的表达条件下,表达产物主要以包涵体存在,表达量占菌体总蛋白的37.5%。间接ELISA结果表明融合蛋白具有一定的免疫原性,保留了天然蛋白的部分抗原性。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的优化表达及活性检测

通过软件分析后,截去猪圆环病毒2型ORF2基因中影响蛋白表达的保守基因,并对其余的基因进行了密码子优化。把改造后的ORF2基因连接到pGEX-4T-1载体上并转入表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。结果显示,重组菌可以表达出分子质量为50ku的重组蛋白,在0.2mmol/L的IPTG诱导5h情况下表达效果最好,表达的蛋白以包涵体形式存在于菌体中。表达产物经琼脂糖凝胶纯化可得到较纯的蛋白。经Western-blot分析,所纯化的蛋白能刺激小鼠产生相应抗体,并能与PCV2阳性血清进行特异性免疫印迹反应。试验结果证实表达的蛋白具有良好的抗原性。     

高铜诱导肉鸡肌胃和腺胃发生自噬与凋亡

为了探讨高铜对肉鸡肌胃和腺胃发生自噬与凋亡的影响,本试验选用240羽1日龄AA白羽肉鸡作为试验动物,并随机分为4组,分别饲喂含铜11 mg/kg(对照组)、110 mg/kg(高铜Ⅰ组)、220 mg/kg(高铜Ⅱ组)和330 mg/kg(高铜Ⅲ组)的日粮,并于49日龄采集肌胃和腺胃,制作组织切片观察组织学变化,采用实时荧光定量PCR检测自噬和凋亡相关基因的mRNA表达,免疫印迹检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Caspase3的蛋白表达。结果显示,高铜可引起肌胃中肌纤维稀疏,腺胃中的腺细胞发生脱落以及空泡变性。另外,高铜可显著上调肌胃和腺胃中自噬相关基因Beclin1、Atg5、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和凋亡相关基因Bax、Bak1、p53、Cyt C和Caspase3的表达,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Caspase3的蛋白表达水平也显著升高,而mTOR和Bcl2的mRNA转录水平则显著下调。此外,腺胃和肌胃中p62的mRNA转录水平呈现先降低后升高的趋势。结果表明,高铜可诱导肉鸡的肌胃和腺胃发生自噬和凋亡。     

甘草多糖对肉鸡免疫功能的影响

研究在日粮中添加不同水平甘草多糖（GCP）对肉鸡免疫功能的影响。选用320只1日龄AA肉鸡,随机分成5组,每组4个重复,每个重复16只。对照组饲喂基础日粮,其他4组分别饲喂添加甘草多糖 200、500、1 000和1 500 mg/kg的试验日粮。在21和42日龄时,从每个重复随机抽取4只接近平均体质量的肉鸡,空腹称重,翅静脉采血制备血清,测定血清IgM、IgG、IFN-γ、IL-2、IL-6的质量浓度和新城疫抗体水平;然后处死,摘取免疫器官脾、胸腺、法氏囊并称重,测定免疫器官指数;最后剪取小块脾,用来测定IL-2、IFN-γ、IL-1β mRNA相对表达量。结果显示：500 mg/kg组和1 000 mg/kg组的GCP可以显著提高21日龄时肉鸡脾、胸腺和法氏囊指数（P0.05）,1 000 mg/kg组和1500 mg/kg组均能显著提高42日龄时肉鸡脾指数（P0.05）;添加GCP能显著提高21日龄时肉鸡血清中IgM、IL-6、IFN-γ的质量浓度和新城疫抗体水平（P0.05）,并能显著提高42日龄时肉鸡血清中IgM、IL-6和IL-2的质量浓度（P0.05）,其中500 mg/kg组和1 000 mg/kg组GCP血清免疫球蛋白和细胞因子质量浓度较高;GCP能显著提高脾IL-2基因mRNA表达水平和21日龄时脾IFN-γ 基因mRNA表达水平（P0.05）。结论：在日粮中添加GCP可在一定程度上提高肉鸡的免疫器官指数、新城疫抗体水平、免疫球蛋白、细胞因子和脾相关细胞因子的基因表达水平,提高机体免疫功能。