犬半月板脱细胞基质支架的制备及其特性的研究

半月板是膝关节中的基础纤维软骨组织。损伤半月板会损害正常膝关节功能和易患骨关节炎。人和其他动物半月板的脱细胞处理均有文献报道,但犬半月板的脱细胞支架制备鲜有文献报道。本研究采用高低渗反复冻融和1%十二烷基硫酸钠溶液(SDS)脱细胞处理,制备犬半月板脱细胞基质支架。通过HE染色、天狼猩红染色、阿尔新蓝染色和DNA含量测定检测细胞脱除成度。组织学观察和扫描电镜结果显示犬半月板的胶原纤维主要呈线性沿圆周方向排列,鲜有径向排列,细胞陷窝沿纤维束排列。力学性能检测显示,脱细胞基质与天然半月板相比压缩模量有所降低,这与阿尔新蓝染色显示的脱细胞后蛋白多糖丧失具有一定的关系。体外细胞毒性测定结果表明半月板脱细胞支架对犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)没有毒性。细胞增殖、扫描电镜观察和活/死细胞染色试验表明犬BMSCs可粘附于支架并且不断增殖。这说明犬半月板脱细胞基质支架可作为构建组织工程半月板的支架。     

反复冻融新生牛血清对促细胞生长效应的影响

选择促细胞生长性能良好的三批新生牛血清 ,经不同次数冻融后用其配制MEM培养液 ,用于培养SP2 / 0细胞 ,从细胞最大增殖量和倍增时间 2个指标测定促细胞生长效应。结果 ,用经不同次数冻融的新生牛血清配制的MEM培养液 ,对SP2 / 0细胞的最大增殖量和倍增时间影响不大 ;但反复冻融 2 0次以上的新生牛血清配制的培养液使细胞的倍增时间延长。由此可见 ,为了防止细胞倍增时间延长 ,所用新生牛血清的冻融次数应该控制在 2 0次以内     

干细胞的新来源——羊膜

为了给羊膜干细胞深入研究提供借鉴,介绍了羊膜的组织特点,综述了羊膜上皮干细胞及羊膜间充质干细胞的生物学特性及其诱导的潜能和鉴定方法,并对其在临床医学应用的前景进行了展望。提出羊膜组织来源的干细胞为干细胞的研究提供了新来源、新思路。     

猪肺炎霉形体膜制备方法对膜活性影响的研究

以猪肺炎霉形体为材料 ,分别采用反复冻融、低渗裂解、超声破碎等方法进行破膜试验。从膜蛋白收获率、标志酶活性、膜毒性等方面加以分析 ,以探索获取膜制剂的最佳条件。结果表明 ,采用低渗冻融超声相结合的膜制备方法使膜蛋白的收获率达 3 0 %左右 ;ATPase活力及膜毒性良好     

猪血管内皮细胞体外生长特性的研究

试验以体外分离培养的猪血管内皮细胞为材料 ,研究了细胞的生长曲线、不同基础培养基对细胞生长的影响及胰岛素在生长液中的适宜含量。结果表明 ,传代猪血管内皮细胞接种后有1d左右的滞留期 ,然后细胞进入对数生长期 ,可持续 2d ,第 5d进入平台期 ,第 8d细胞开始脱落死亡 ;与MEM相比 ,M 199更适合于用作培养猪血管内皮细胞的基础培养基 ;在不用贴附基质和内皮细胞生长因子 (ECGF)的条件下 ,生长液中加入胰岛素 ,可明显促进细胞的生长和增殖 ,胰岛素的最适用量为 8μg/mL。     

丙酸睾酮对神经支架桥接修复犬坐骨神经缺损的作用

为研究丙酸睾酮对神经脱细胞支架桥接修复犬坐骨神经缺损的作用,选杂种犬6只,手术制备坐骨神经3 cm缺损模型,并用同种异体神经脱细胞支架桥接修复,将修复犬随机均分为试验组和对照组。试验组在犬修复肢小腿外侧注射丙酸睾酮;对照组在犬相应部位注射等量生理盐水。术后4个月,行肌电图检测、腓肠肌湿重比率、腓肠肌和修复神经的组织形态学观察。结果显示,试验组和对照组腓肠肌湿重比率分别是(77.73±2.72)%、(64.59±3.98)%,神经传导速度分别是(21.23±2.23)m/s、(15.7±1.02)m/s,波幅分别是(1.64±0.89)mv、(1.28±0.82)mv。两组间湿重比率、传导速度、波幅均差异显著(P0.05)。试验组中的再生神经纤维数量多于对照组,板层结构清晰完整且优于对照组。结果表明,丙酸睾酮对同种异体神经脱细胞支架桥接修复犬坐骨神经缺损和生理功能恢复均具有促进作用。     

大白鼠牙髓组织超微结构的观察

为研究大白鼠牙髓组织超微结构与牙本质组织学的联系 ,采用电镜对 10只大白鼠牙髓组织及牙本质的超微结构进行观察 ;并对牙齿硬组织的固定、脱钙方法进行探讨。结果 ,(1)全牙组织固定保持牙髓与牙本质的原位、原貌 ,使其呈现正常解剖关系。 (2 )选用 5 0mL/L硝酸乙醇脱钙液 ,可维持牙髓组织细胞内外环境渗透压的相对平衡 ,使组织细胞接近于正常生物特性。 (3 )牙髓组织中含有成牙本质细胞 ,其胞质伸入牙本质基质中 ,且有细胞器存在 ,核周围有明显的高尔基复合体 ,胞质中出现电子密度高的圆形颗粒 ;牙髓细胞有丰富的细胞器及扩张的粗面内质网 ,其腔内有着色均匀的电子密度中等的絮状物质 ,在牙髓细胞之间有呈颗粒状细丝物质含有胶原原纤维及柯夫 (Vonkroff)纤维 ,此外尚有组织细胞及未分化的间叶细胞。提示 ,大白鼠的牙髓及牙本质的组织结构具有人牙髓的一般生物性质 ,可作为人工龋及牙周组织疾病发病机理的研究及临床防龋药物及口腔充填材料的易感实验动物     

牦牛胎儿成纤维细胞的分离培养

采用30d胚龄左右的牦牛胚胎,用2种不同的消化液消化后,将所得的牦牛胎儿成纤维细胞(yak embryonic fibroblasts,YEF)培养于不同血清含量的RPMI1640培养液中,并接种于2种不同材质的培养瓶表面,对YEF的分离方法、培养所需胎牛血清(FBS)添加量和不同基质表面对YEF生长的影响进行了研究。结果表明,含150 mL/L FBS的RPMI1640培养基最适合YEF生长,可传代27次以上;经用RPMI1640和D-Hank’s液配制的2．5 g／L胰蛋白酶消化,所得的YEF的细胞活率差异不显著(P>0．05),其原代细胞在含100 mL／L胎牛血清的RPMI1640培养液中的贴壁率差异极显著(P<0．01);不同生长基质对YEF的形态没有显著影响。     

IBD琼扩试验抗原和血清的制备与应用

目前,诊断鸡传染性法氏囊病(IBD)主要应用中和试验和琼脂扩散试验(AGP),特别是A-GP敏感特异,简便易行,很适合在基层兽医单位推广和应用。近2年来,我们从生产实际出发自制了4批AGP抗原和血清,用于对IBD的临床诊断。 (一)试验材料 1.IBDV(标准抗原):由江苏农学院微生物组提供。 2.IBDS(阳性血清):由南京农业大学兽医微生物组提供。效价1:64。 3.阴性血清:取自健康无IBD鸡血清。 4.阴性抗原:取自健康无IBD鸡法氏囊,经反复冻融6次,低温冷浸过夜的均浆。 5.被检自制抗原的选择:共9组:①取病变法氏囊组织小片;②按1:1加入PBS液制成组织均浆;③组织均浆经冻结保存,反复冻融4～6次,以3000r/min离心1小时,取上清液;④南京D_(78)疫苗;⑤上海松江产弱毒苗;⑥江苏省家禽所产弱毒苗;⑦江苏农学院生产的细胞苗;⑧江苏农学院生产的鸡胚克隆苗;⑨阴性抗原组织作对照。     

马立克病病毒单克隆抗体的制备

以纯化的经鸡胚成纤维细胞(CEF)培养的马立克病病毒(MDV)超强毒株GX0101病毒粒子作为免疫原,制备特异性识别MDV的单克隆抗体。GX0101感染CEF后第96小时收集细胞并反复冻融3次,离心取上清,选用100 ku的切向流超滤离心管浓缩,浓缩液通过Sepharose 4 Fast Flow(4FF)凝胶作为层析介质分离纯化MDV病毒粒子,聚合酶链反应(PCR)和实时荧光定量PCR分析不同收集峰MDV病毒含量,并经过透射电子显微镜观察到直径约100 nm的MDV病毒粒子。进一步用100 ku的切向流超滤离心管浓缩,制备峰尖病毒浓缩液,以此免疫雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和Western-blot筛选,最终获得107个阳性克隆,由其中1株强阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株10B2制备的单克隆抗体腹水IPMA效价为1∶2.56×10~6。本研究结果为后续MDV单克隆抗体的筛选、鉴定及诊断试剂研发奠定了重要基础。     

人胚胎原始生殖细胞的原代培养

从 5～ 9周人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞 (PGC) ,将其置于经过丝裂霉素C处理过的单层小鼠胚胎成纤维细胞 (PMEF)饲养层上培养。结果 ,经过培养形成的克隆以及克隆的生长方式基本符合小鼠胚胎干细胞 (ES)的特性 ,表现为细胞核大 ,细胞排列紧密 ,界限不清 ,集落边缘可见分化的成纤维细胞等 ;将其接种于裸鼠皮下 ,经过 2 9d生长 ,得到具有 3个胚层组织结构的畸胎瘤     

牦牛子宫内膜细胞的分离培养及性激素对其增殖的影响

为了分离培养牦牛子宫内膜细胞,并探讨不同浓度雌激素和孕激素对上皮细胞和基质细胞增殖的影响,采用Ⅰ型胶原酶消化、离心分离和差速消化纯化的方法分离纯化上皮细胞和基质细胞,对其进行免疫细胞化学染色鉴定,绘制生长曲线,最后用MTT法测定不同浓度的17β-雌二醇和孕酮对细胞增殖的影响。结果显示,1g/L胶原酶消化1h,500r/min离心10min,经2代差速消化纯化获得的上皮细胞的纯度为96%,基质细胞的纯度为93%;不同浓度的17β-雌二醇均能促进上皮细胞和基质细胞的增殖,孕酮可促进基质细胞的增殖,但对上皮细胞的增殖有抑制作用,不同浓度的17β-雌二醇和孕酮共同作用均能显著促进基质细胞增殖,而对上皮细胞增殖的影响随混合液中孕酮浓度的增加由促进转为抑制。本研究获得了高纯度的牦牛子宫内膜上皮细胞和基质细胞,证实雌激素能促进2种细胞的增殖,孕激素能促进基质细胞的增殖但抑制上皮细胞的增殖。     

猪脾细胞干扰素的制备及其若干性状的研究

1980年苏联学者报告了猪血白细胞干扰素可以在人源细胞上表现较高的抗病毒活性。我们考虑到猪血白细胞干扰素有可能用于人体滴鼻预防流感等病毒性疾病。但在制备中处理猪血有较多不便,因而改用猪脾细胞制备干扰素(PS—IFN)。经过二年的实验研究,试制了42个猪脾,建立了常规生产工艺,并测定了一些理化和生物学性状,于1984年9月PS—IFN已试制成功。 材料与方法 (一)材料 诱生用鸡新城疫病毒(NDV)F系减毒株,购于湖南生物药厂。攻击用     

猪水肿病中大肠杆菌有关毒素的研究

材料与方法 (一)病猪肠内容物 选择临床症状和病理变化比较典型的病猪,死后立即作细菌学检查,肝、脾、心血及胃肠水肿液均无菌生长,肿胀的肠系膜淋巴结组织涂抹培养分离出大肠杆菌者。将5头病猪肠内容物混合,加三倍生理盐水稀释,经3000转分离心30分钟,/放入冰箱保存备用。为观察除菌后的肠内容物的致病能力,用10000转/分离心1小时,取上清液做为接种材料。 (二)琼脂培养菌体冻融液 所用菌株是从病猪肠系膜淋巴结中分离的,鉴定为O_(139):     

牦牛IBR病毒85-Y株电镜观察及理化特性鉴定

牦牛IBR病毒85-Y株的分离,血清学鉴定及回归本动物试验已相继报道。现将对该毒株的电镜观察及理化特性鉴定的结果报告如下。 (一)材料与方法 1.细胞:供试验用的犊牛肾(BK)继代细胞系按常规方法制备。生长液含健康犊牛血清10％,乳汉液45％,199培养液45％,pH7.0～7.2。维持液为pH7.2—7.4之乳汉液。 2.种毒:85-Y株冻干毒在BK继代细胞上再传3～5代作为以下各项试验的种毒,接种细胞单层前均经3次冻融,3500rpm离心20分钟。     

山羊背根神经节神经细胞的原代培养及鉴定

从胎龄3个月左右的山羊胚胎中分离出背根神经节,采用组织块培养法,利用血清培养和无血清培养,并在非神经细胞抑制剂作用的条件下,观察了山羊背根神经节神经细胞在体外的生长状况,采用免疫荧光和RT-PCR技术对神经细胞表面标志神经元特异性磷酸化酶(NSE)进行了鉴定。结果显示,接种48h后的细胞从组织中迁出,并长出突起,经阿糖胞苷作用后,神经细胞与非神经细胞分层;经免疫荧光鉴定,上层细胞为神经细胞。随着时间的增加,神经细胞突起延长并交错成网状,至第6～10天神经细胞形态最为成熟饱满,随后逐渐出现细胞老化,神经细胞最长可生存32d。表明本试验成功分离培养得到了山羊背根神经节神经细胞。     

猪囊尾蚴cDNA表达文库的免疫筛选

用质粒表达载体pSPORT 1构建了猪囊尾蚴cDNA文库。将已构建好的cDNA表达文库用SOC按一定比例稀释后 ,均匀涂布于LB板 (Amp )上 ,37℃培养箱中倒置培养过夜。将生长良好的菌落转印于NC膜 ,并将此膜置于加有IPTG的LB板上 ,37℃诱导培养 4h。取下NC膜 ,在氯仿蒸气中熏蒸 15min后 ,在裂解液中过夜裂解。经洗膜、封闭 ,加人囊尾蚴阳性血清 ;再洗膜、封闭 ,加羊抗人IgG HRP ,与底物作用后 ,初步筛选得到了阳性克隆。对可疑阳性克隆 ,用同样方法反复筛选 ,直到完全确定为止     

犊牛前脂肪细胞的培养及其增殖与分化模型的建立

选择犊牛小肠网膜、附睾脂肪垫、腹部皮下脂肪组织材料 ,应用原代消化细胞培养法培养细胞。结果 ,由小肠网膜培养出了成分均一、增殖旺盛、分化率高的梭形细胞。经形态学动态变化观察、生长曲线测定、油红O脂肪染色及对胰岛素反应的测定 ,证明为功能活跃的前脂肪细胞 ,并在体外重现了其增殖、肥大的全过程。结果显示 ,小肠网膜脂肪组织存在着功能活跃的可调控的前脂肪细胞     

弓形虫在培养细胞中生物学特性的观察

弓形虫是寄生在细胞内的一种原虫,能够在多种具核培养细胞中生长繁殖,并具有多种多样的增殖性状。但是有关弓形虫速殖子在不同培养细胞上具体的侵入增殖情况及其生物学特性尚不十分明了,从而也就无法选择适宜繁殖的培养细胞和未能确切掌握其在培养细胞上的增殖率及其最佳增殖时机。为弄清这一问题,对弓形虫在培养细胞中生物特性作了观察。     

锥虫病和肝片吸虫病双联诊断液的研制

我们曾先后研制了锥虫病,肝片吸虫病单能诊断液,并已用于耕牛上述疾病的普查。之后根据在同一红细胞上可以附载多种抗原测定多种抗体的原理,又进行了锥虫和肝片吸虫两病双联诊断液的研制。 (一)材料与方法 1.抗原制备 (1)锥虫抗原制备:取液氮保存的锥虫,用大白鼠增殖,待虫体达高峰时放血、离心,取棕黄层细胞,过DEAE纤维素柱分离虫体。将纯净虫体冻融后超声波处理、离心,取上清液作抗原,低温保存备用。