H3N8亚型马流感病毒VLPs的构建及其生物学特性分析

为了构建含H3N8亚型马流感病毒HA蛋白和M1蛋白的病毒样颗粒疫苗,把A/equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)的HA基因和M1基因克隆到杆状病毒穿梭载体pFastBac Dual中,将得到的重组穿梭质粒pFBD-XJ3HA-M1转化至DH10Bac感受态细胞,与杆状病毒骨架质粒Bacmid进行重组从而获得重组杆状病毒转座子rBac-XJ3HA-M1,然后将其转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBV-XJ3HA-M1。通过PCR鉴定、细胞免疫组织化学试验、Western-blot分析以及血凝试验证明,HA蛋白和M1蛋白在昆虫细胞中能够有效表达,且表达产物具有良好的反应活性,表达的HA蛋白具有血凝活性。电镜观察发现,HA蛋白和M1蛋白能够稳定形成病毒样颗粒。上述研究结果为研制马流感亚单位疫苗提供了技术储备,也为马流感病毒蛋白的功能研究奠定了基础。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-T-HA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的 HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。     

小鼠抑制素α亚基在杆状病毒表达系统中的表达和纯化

为利用杆状病毒表达系统表达小鼠的抑制素α亚基基因(INHα),将模板质粒pcDNA3.1(+)-INHα中的INHα基因克隆至载体质粒pFastBac1中,构建出重组转座质粒pFastBac1-INHα,转化至感受态DH10Bac细胞,形成重组穿梭质粒Bacmid-INHα,转染至Sf9细胞,获得第一代重组杆状病毒(P1)。然后病毒连续传代2次,用RT-PCR鉴定重组的杆状病毒,用SDS-PAGE验证纯化后蛋白质的表达,并使用BCA蛋白质浓度检测试剂盒检测纯化后的蛋白质样品的质量浓度。结果表明,感染重组杆状病毒后的Sf9细胞能够明显看到细胞皱缩、碎裂等感染症状;RT-PCR能够扩增出1 272bp的条带,证明重组的杆状病毒构建正确;SDS-PAGE结果表明重组的杆状病毒能够表达出45ku的条带,与理论大小一致;利用BCA蛋白质浓度检测试剂盒测得纯化样品中蛋白质的质量浓度为(216.05±10.02)μg/mL。小鼠抑制素α亚基成功地在杆状病毒表达系统中被表达,为今后抑制素的广泛应用奠定了基础。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及其表达产物的生物学活性

根据GenBank上登录的H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因序列设计引物,通过PCR扩增出A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)毒株的NP基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,将筛选的阳性重组转座载体pFastBacGP67B-NP转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,构建了杆状病毒表达载体,获得了重组转座子(rBacmid-NP),在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBv-NP).SDS-PAGE分析、Westernblotting检测、免疫组化分析和ELISA试验结果表明,分子质量约为54 ku的重组核蛋白得到了高效表达,该表达蛋白具有良好的生物学活性.     

H3N8亚型马流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其生物学特性的研究

为了构建表达H3N8亚型马流感病毒HA蛋白的重组腺病毒,把A/Equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)的HA基因克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,将重组穿梭质粒pShuttle-XJ3HA电转化至BJ5183感受态细胞中,与人5型腺病毒骨架质粒同源重组,获得了重组腺病毒质粒pAd-XJ3HA。该质粒线性化后转染AD293细胞,包装重组腺病毒rAd-XJ3HA。通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot鉴定,证明HA基因已整合到腺病毒载体基因组中,并能够有效表达。该重组腺病毒在AD293细胞上连续传15代后仍表现出良好的遗传稳定性。马流感病毒HA基因重组腺病毒的成功构建为我国马流感重组病毒活载体疫苗的研究提供了技术储备。     

番鸭细小病毒样颗粒的制备与鉴定

为在昆虫细胞中表达番鸭细小病毒主要结构蛋白VP3,并探讨重组蛋白VP3能否在昆虫细胞中自动组装成病毒样颗粒,高保真扩增VP3基因,克隆入杆状病毒转移载体pFastBac1中,获得重组转移质粒pFB-VP3,转化DH10Bac感受态细胞,经抗性、蓝白斑筛选及PCR鉴定,得到重组Bacmid DNA。将其转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒rBac-VP3,利用SDS-PAGE、Western-blot、间接免疫荧光试验对重组蛋白的表达情况进行检测,负染电镜观察病毒样颗粒,并通过Western-blot对病毒样颗粒进行鉴定。SDS-PAGE和Western-blot结果表明重组蛋白大小正确。间接免疫荧光试验结果显示,重组蛋白获得了成功表达。利用负染电镜可观察到直径约20 nm的典型二十面体病毒样颗粒。Western-blot结果显示该病毒样颗粒由VP3蛋白组成。本研究首次成功利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统制备了番鸭细小病毒样颗粒,为番鸭细小病毒病新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

禽流感病毒GD/1/96株M基因在sf9昆虫细胞中的表达

从pUCM 1质粒中亚克隆禽流感病毒M基因至转移载体 pFastBac1质粒 ,PCR鉴定后 ,转化DH10 BAC感受态细胞。提取重组杆粒rBacM ,以M 13为通用引物作PCR分析 ,证明M基因已转入其中。用CellFectin试剂包裹rBacM杆粒转染sf9细胞 ,96h收取感染细胞。细胞表达产物裂解后作SDS PAGE蛋白电泳和Westernblot分析 ,证明M基因在昆虫细胞中成功表达且具有与天然M 1蛋白相似的活性。琼脂扩散试验结果进一步证明 ,重组M 1蛋白可作为诊断抗原。     

H1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及其在浙江省的应用

利用RT-PCR扩增了猪流感病毒分离株A/Swine/Zhejiang/103/2002(H1N1)HA1基因,并将其克隆至pFastBacHTA杆状病毒转移载体。将筛选的阳性重组转移载体pFastBacHTA-HA1转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,构建重组转座子rBacmid-HA1。之后转染Sf9昆虫细胞制备rBV-HA1重组杆状病毒。SDS-PAGE分析显示,重组表达的HA1蛋白的分子质量约为45ku。Westernblot结果显示,该HA1蛋白能与H1亚型猪流感阳性血清特异性结合,具有良好的抗原活性。利用镍柱纯化后的HA1蛋白作为包被抗原,建立了H1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法,通过对各种条件进行优化,确定了最佳反应体系。该方法与多种猪病毒阳性血清无交叉反应性,与HI方法的符合率为92.4%,与IDEXX进口试剂盒的符合率为94.6%。用该方法对2014年从浙江省规模化猪场采集的猪血清进行检测,阳性率为17.4%(589/3 379)。该方法的建立为浙江省猪流感的监测及防控提供了重要检测工具。     

H3亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA检测方法的建立

根据GenBank上登录的H3亚型猪流感病毒HA基因序列设计了1对引物,经PCR扩增出HA基因目的片段,并将其克隆到pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67C-H3,转化至含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-H3,在脂质体介导下转染处于对数生长期的sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-H3,将其感染sf9昆虫细胞,收获目的蛋白。经血凝试验、SDS-PAGE、Western-blot、免疫组织化学分析,结果表明,HA蛋白得到表达,且具有良好的免疫学活性。用表达的HA蛋白作为包被抗原,初步建立了H3亚型猪流感病毒的间接ELISA检测方法,通过对93份送检的疑似猪流感血清进行检测,结果显示,检出阳性率为46.24%。上述结果为建立快速、准确、简便的H3亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定了基础。     

牛疱疹病毒1型gE蛋白胞外区基因的杆状病毒表达及其表达产物的免疫反应性

为获得具有生物学活性的牛疱疹病毒1型(BHV 1)囊膜糖蛋白gE,采用PCR方法从BHV 1感染的牛肾细胞全基因组中扩增出约1.7kb的gE基因,再将1 176bp的gE胞外区基因片段克隆到新型杆状病毒载体pFastBac-LIC-Bse中,构建重组转移质粒pFB-gE。将pFB-gE转化到杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,制备重组杆粒rBacmid-gE。将该重组杆粒的DNA转染昆虫细胞Sf9,获得与gE基因发生重组的杆状病毒。Western-blot分析及间接免疫荧光试验(IFA)的结果显示,重组杆状病毒在Sf9中表达了分子质量大小约为43ku的gE融合蛋白,该融合蛋白分别与小鼠抗His标签单克隆抗体和小鼠抗BHV 1多克隆抗体发生特异性结合,表明获得的gE融合蛋白具有良好的免疫反应性。本研究为进一步获得高特异性的诊断抗原奠定了基础。     

俄语“人体成语”的认知语义分析——以带глаз,нос的成语为例

“人体成语”是指含有表示人体各部位名称及关于人的知、情、意、行等语素的成语。俄语成语中与人体有关的成语所占比例较高，其中使用频率较高的是带глаз,нос的成语。从认知角度对俄语“人体成语”的构成成素进行分析，区分人体成语的概念意义和范畴意义，用隐喻模式和换喻模式对“人体成语”进行认知语义分析很有必要。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

俄罗斯科学院东方学研究所

俄罗斯科学院东方学研究所是俄罗斯最大的东方学研究机构。东方学研究所及其下属的圣彼得堡分所,是俄罗斯研究中国问题时间最长的机构之一。研究所机构设置齐全,既是科学研究机构,也是博物馆和图书馆,在国际学术界占有重要地位。历史渊源东方学所至今已有180年历史。1818年,东方学所的前身——俄罗斯皇家科学院亚洲博物馆在圣彼得堡成立。首任馆长为克里斯汀·弗伦院士。成立之初,亚洲博物馆主要收藏各种来自东方的文物和文献,当时博物馆最重要的藏品是彼得大帝的遗书。到19世纪初,俄罗斯探险家在中亚和中国西北地区掠夺的大量珍贵文献和文…     

"中国学派"国际关系理论的本体论认知

"'中国学派'国际关系理论框架到底是什么"已成为学界关注的一个重要问题.本文立足中国哲学的文化根基,同时尊重马克思主义的思想传统,将两者融合成新的本体论认识,以"陆王"心学的认识论作为过渡进一步论述儒家思想在国际关系方面的方法论原则,提出"中国学派"国际关系理论的基本认知,尝试在哲学意义上回答"‘中国学派'国际关系理论框架到底是什么"这一问题.     

布洛芬-β-环糊精包合物的制备及其药剂学性质的研究

采用共沉淀法制备了布洛芬(ibuprofen,BF)-β-环糊精(β-cyclodextrin,β-CD)包合物.经差示扫描量热法、红外光谱法、核磁共振法鉴定,BF与β-CD确已形成包合物;溶解度试验证明,β-CD对BF具有显著的增溶效果;3批产品的平均含药量为11.98%±0.35%,平均产率为79.83%±0.43%;溶出度试验结果显示,45 min内包合物中药物的溶出度比原药BF的溶出度显著加快(P＜0.01).     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

印度软件企业生产国际化的组织实施

印度软件企业出口生产的国际分工特征表现为:区域分工以现场服务和离岸开发为主,技术分工以编程、测试和维护为主。通过设立软件技术园区作为出口生产基地以发挥企业区域集群优势和利用跨国公司技术创新国际化趋势进行跨国生产和研发来组织实施的。     

猪囊尾蚴病免疫原的分子生物学研究进展

猪带绦虫有成虫、虫卵、六钩蚴、囊尾蚴不同形式的发育阶段和寄生状态 ,不同的虫体形式以独特的组织结构和生命活动规律满足其寄生在相应宿主体内的需要[1 ,2 ] 。研究发现 ,六钩蚴与囊尾蚴在虫体组成成分、生化指标以及代谢 (分泌 )产物等方面都有差异。SDS PAGE和免疫印迹研究表明 ,六钩蚴的抗原成分非常复杂 ,不仅有共同抗原、阶段发育特异性抗原 ,而且在入侵宿主定植在肌肉组织后 ,表面抗原随虫体的发育而发生阶段性的改变 ,并且抗原变异的发生往往比免疫应答更为迅速 ,从而使宿主产生的抗体失去保护性。在生化指标及代谢关键酶方面 …     

对苏获波兰战俘问题的系统考察

本文依据档案资料,对苏获波兰战俘问题的各个环节进行了较为系统的考察,一方面比较清楚地交代了苏联对波兰战俘采取的一系列政策措施,如部分遣返、分类关押、劳动使用、思想教育、侦探肃反和秘密处决等,另一方面也比较清楚地交代了被关押战俘的生活状况、思想情绪、人数变化和不幸遭遇以及所有波兰战俘的流向和归宿.对于"卡廷惨案"被公布于世后苏联围绕该案所作的各种自欺欺人的文章,本文也进行了较为详细的披露和叙述.     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。