绵羊肺炎支原体P113蛋白单克隆抗体的制备及其在免疫荧光检测中的应用研究

P113蛋白是绵羊肺炎支原体重要的免疫原。为了制备针对P113蛋白的单克隆抗体,本研究以原核表达的重组P113蛋白免疫小鼠,制备了1株P113蛋白的特异性单克隆抗体C426,纯化后用异硫氰酸荧光素标记单克隆抗体,并建立了绵羊肺炎支原体的免疫荧光检测技术。结果显示,该株单克隆抗体的ELISA效价为1∶128 000,亚型为IgG2b,轻链类型为κ型,并具有良好的特异性。所建立的免疫荧光检测方法特异性强、灵敏度高,其对绵羊肺炎支原体培养物的检测下限为100 CCU/m L。该方法可以从感染动物的鼻拭子样品或肺组织中成功检测到绵羊肺炎支原体,与PCR方法的阳性符合率为86.25%,明显高于支原体分离培养的方法。本研究制备的P113蛋白单克隆抗体以及免疫荧光技术不仅为绵羊肺炎支原体感染的诊断提供了新的手段,同时为进一步研究P113的功能提供了良好的工具。     

绵羊肺炎支原体P108蛋白的分子特征分析及免疫原性研究

为进一步探究绵羊肺炎支原体P108蛋白的结构及其免疫原性,在进行生物信息学分析的基础上,对编码P108的部分基因片段进行了PCR扩增、克隆和原核表达,并采用Western-blot方法对其免疫原性进行了分析。结果显示,p108基因与猪肺炎支原体黏附相关基因mhp385的核苷酸同源性较高,扩增的p108部分基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在;重组蛋白可以与山羊抗绵羊肺炎支原体血清发生结合反应,表明P108蛋白是免疫原之一。本研究结果表明P108蛋白可以诱导机体产生免疫应答,是建立绵羊肺炎支原体感染血清学诊断技术的潜在抗原。     

猪肺炎支原体P97 C末端蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位分析

以大肠杆菌表达的pET-30a-P97C重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备针对猪肺炎支原体P97C末端蛋白的单克隆抗体,并将其与截短表达的P97C末端蛋白进行免疫印迹分析,初步鉴定了P97C末端蛋白的抗原表位。进一步采用肽探针扫描技术确定最小抗原决定区域,并通过生长抑制试验及抗黏附特性试验对抗原表位进行了分析。结果显示,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株A3C9和B4D5,并成功鉴定出P97C末端蛋白的2个独立线性表位F905PMAFSY911和G991TPNQGKKAE1000。2株单抗对猪肺炎支原体的生长均有一定的抑制作用,但对其黏附特性没有显著抑制作用。     

山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白的免疫原性

通过免疫印迹试验对山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白及M1601株全菌蛋白进行了免疫原性分析,并与绵羊肺炎支原体抗血清和丝状支原体山羊亚种抗血清进行了比较,以筛选M1601株特异性的外膜蛋白。结果表明,存在于外膜蛋白中的分子质量分别为60.0和49.7 ku的蛋白是其主要的免疫原性蛋白,也是山羊支原体山羊肺炎亚种区别于丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体的主要特异性抗原,这一结论为山羊传染性胸膜肺炎的诊断和疫苗研制奠定了良好的理论基础。     

绵羊肺炎支原体荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立快速检测绵羊肺炎支原体的荧光定量PCR方法,根据EF-Tu基因序列设计合成引物,构建含有EF-Tu基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并用于临床样本的检测。结果显示,本研究建立的方法能特异性扩增绵羊肺炎支原体,与其他病原无交叉反应,最低检测限为5 copies/L,在5×104~5×109稀释度范围内具有良好的线性关系(r2=0.996),检测的批内和批间变异系数均小于5%。对临床肺组织样本中绵羊肺炎支原体的检出率(105/134,78%)与基于P113基因的q RT-PCR方法的相符,而对鼻腔棉拭子样本的检出率(27/50,54%)略高于后者(25/50,50%)。对人工感染绵羊肺炎支原体山羊肺的病变部位、病健交界部位和无明显病变部位的检出率分别为1/6、6/6和4/6,确定肺的病健交界部位为最佳采样部位。对采自四川、新疆、青海的439份表观健康羊肺绵羊肺炎支原体的平均检出率分别为48%(61/126)、63%(103/163)和75%(113/150),提示受检羊群仍存在严重的绵羊肺炎支原体带菌感染情况。该方法的建立对绵羊肺炎支原体感染的监测与快速诊断有重要意义。     

山羊支原体山羊肺炎亚种黏附相关蛋白的特性

为鉴定山羊支原体山羊肺炎亚种的黏附相关蛋白,通过对山羊支原体山羊肺炎亚种基因组编码的假定的膜蛋白基因(0297)进行扩增,并连接到pET-32a(+)载体,转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导获得了以可溶形式表达的重组蛋白,大小约为43ku,将该重组蛋白命名为P0297。用纯化的P0297免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。利用激光共聚焦显微镜观察到蓝色的细胞核周围有重组蛋白的绿色荧光存在,其外形与细胞膜的红色荧光基本重合,表明P0297对山羊气管上皮细胞有明显的黏附作用。夹心ELISA结果显示,重组蛋白P0297的黏附作用与蛋白浓度成正比,并且黏附作用可被多克隆抗体阻断,说明该重组蛋白的黏附为特异性黏附。上述结果表明,P0297蛋白是山羊支原体山羊肺炎亚种的一个黏附相关蛋白。     

绵羊肺炎支原体特异性分子检测靶标的筛选与应用

本文旨在筛选出特异性的绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)分子检测靶标,利用全基因组BLASTn筛选出绵羊肺炎支原体特异性蛋白基因序列,再运用NCBI线上Primer BLAST程序,选择G/C含量较高的4个靶基因设计11对引物,通过引物筛选和反应条件的优化,成功筛选到一对针对靶标728序列的特异性引物728 2F/2R。用该引物对53株绵羊肺炎支原体菌株、15株其它支原体和18株常见反刍动物细菌的DNA进行扩增,并对27份临床样品进行检测。结果显示,7282F/2R只能从绵羊肺炎支原体菌株DNA扩增出288 bp目的片段,且具有良好的敏感性,与已发表方法相比特异性更好,更适合于绵羊肺炎支原体检测。     

绵羊肺炎支原体P130蛋白主要抗原域原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

为建立绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)快速检测方法,本试验以绵羊肺炎支原体膜蛋白P130为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法。根据基因功能预测注释,绵羊肺炎支原体(Mo)P130蛋白显示编码大小约为130.5 ku,本试验以Mo全基因组为模板,使用PCR扩增Mo P130的基因片段,根据生物信息学软件分析,选取P130主要抗原域P130-3(693 bp),构建P130蛋白主要抗原域原核表达载体pET32a-P130-3,并转化至BL21菌,在0.8 mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。以P130-3为诊断抗原,经过优化反应条件,建立检测Mo抗体的间接ELISA方法。结果表明,表达的P130-3蛋白经鉴定大小为43 ku,与预期值相符。P130-3-ELISA方法阴、阳判定临界值为:D_(450)值=0.238,该方法与口蹄疫等阳性血清均无交叉反应,具有极强的特异性。组内变异与组间变异均小于5%,具有很好的重复性,利用该方法与兰州兽医研究所推出的间接血凝法对200份临床样本进行检测,两者的符合率在90%以上。本研究建立的Mo间接ELISA方法可用于Mo的诊断和流行病学调查。     

猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性

应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白Dnak C末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h.用BugBusterTM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性.     

牛支原体P48蛋白的表达及间接血凝检测方法的建立与应用

优化并合成牛支原体的p48基因,将其克隆到pET-32a(+)表达载体上后,转化大肠杆菌BL21(DE3),16℃低温诱导表达,获得可溶性表达的大小约66ku的重组P48蛋白。将纯化后的重组P48蛋白致敏戊二醛和鞣酸处理过的绵羊红细胞,建立了检测牛支原体抗体的间接血凝试验。重组P48蛋白致敏红细胞的最佳质量浓度是20~40μg/mL,牛支原体超免疫血清抗体效价达1∶2 048~1∶4 096。该方法对牛肺疫、牛巴氏杆菌病、牛病毒性腹泻病、布氏杆菌病、结核病、口蹄疫、牛生殖道支原体感染、里奇氏支原体感染、大肠杆菌病阳性血清的检测结果均为阴性。该方法的特异性为100%,敏感性为93.33%。与国外商品化的牛支原体ELISA试剂盒相比,平均符合率为96.15%。对833份田间血清和1 084份乳清进行检测,阳性率分别是15.37%和19.56%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强和重复性好,可用于牛支原体抗体水平检测、牛支原体病的辅助诊断和流行病学调查。     

绵羊肺炎支原体免疫蛋白质组学的初步研究

利用双向电泳及免疫印迹方法对绵羊肺炎支原体MoGH3-3分离株的抗原蛋白进行筛选,并采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱对其进行初步鉴定。结果,共筛选到MoGH3-3株3个主要抗原蛋白点,其中2个被鉴定为延伸因子(elongation factor Tu,EF-Tu),1个为丙酮酸脱氢酶E1-a亚单位(pyruvate dehydrogenase E1-alpha subunit,PDHA)。结果表明,EF-Tu及PDHA是绵羊肺炎支原体主要的抗原蛋白,这为下一步绵羊支原体肺炎基因工程疫苗的研制提供了靶标。     

猪肺炎支原体P97基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

采用PCR扩增了猪肺炎支原体(Mhp)R659株黏附因子P97基因,测定了其核苷酸序列,并将其克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA上。在脂质体介导下将PacⅠ酶线性化的重组穿梭质粒pacAd-P97和腺病毒骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染AD-293细胞,包装出重组腺病毒Ad-P97,用RT-PCR、Westernblot和间接免疫荧光试验检测重组P97蛋白在AD-293和PK15细胞中的表达。之后,用Ad-P97抗血清检测Mhp对宿主细胞的黏附作用以及Ad-P97在仔猪体内的免疫应答反应。结果显示,P97基因由3 339个核苷酸组成,共编码1 113个氨基酸,其核苷酸序列高度保守;重组P97蛋白可在Ad-P97感染的AD-293细胞和PK15细胞中高效表达,但Ad-P97不能在PK15细胞中增殖并引起细胞病变;Ad-P97具有良好的免疫原性,能抑制Mhp对PK15细胞的黏附作用,诱导免疫仔猪产生Mhp凝集抗体。上述结果为进一步研制安全、高效的Mhp重组疫苗奠定了基础。     

吕氏泰勒虫TlSP无跨膜区重组蛋白的表达及反应原性分析

提取吕氏泰勒虫裂殖子的总RNA,采用RT-PCR方法扩增其表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein)基因的cDNA片段,结合生物信息学方法,对TlSP蛋白抗原表位和跨膜区进行预测,设计表达引物,分别扩增得到TlSP全长及逐一去除跨膜区的4个片段,并将其分别克隆至pET-30a原核表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达,并对融合蛋白的反应原性进行分析。结果表明,TlSP融合蛋白的N端具有较好的抗原性,而在C端存在3个跨膜区:185~207 aa、228~250 aa和255~277 aa;SDS-PAGE结果表明,只有去除全部跨膜区的重组载体可成功表达。Western-blot分析表明,TlSP融合蛋白能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、羊无浆体阳性血清无交叉反应。本研究为今后TlSP候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

尤氏泰勒虫OPRT基因的优化表达

为克隆和表达尤氏泰勒虫OPRT基因的功能区片段,并对重组OPRT蛋白的反应原性进行分析,以反转录得到的尤氏泰勒虫cDNA链为模板,PCR扩增出OPRT基因片段,然后将其克隆至pET-30a(+)载体;把构建成功的重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21进行优化表达,对诱导表达的蛋白纯化后用Western-blot分析它与吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫阳性血清是否发生交叉反应。结果显示,OPRT基因获得了不可溶性表达,最佳表达时间为6h,最佳表达温度为28℃,且表达的重组OPRT蛋白分别与上述2种泰勒虫阳性血清发生交叉反应。结果表明,OPRT同源基因也存在于吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫之中。     

类山羊传染性胸膜肺炎诊断和防治的研究——病原诊断

于1987年从甘肃省陇东类山羊传染性胸膜肺炎流行区采取临床可疑的山羊、绵羊病料,进行了一系列病原诊断研究,结果:排除了相关致病因素,如梅迪,维士那,山羊关节炎脑炎(CAE),衣原体及相关致病菌感染和寄生虫侵袭;最终从21例山羊6/6例绵羊病变肺组织中培养分离出支原体13株/4株,分菌率均在60％以上,分离株经初步鉴定后,经英国国际支原体鉴定中心(NCTC)最终鉴定均为绵羊肺炎支原体(M.ovipneumonia);以分离株人工感染健康山羊7只,绵羊3只,结果6/7的山羊,2/3的绵羊于接种后第14天始形成与自然病例相似的病变,并以7/7山羊,2/3绵羊病变肺组织中收回原接种物;以琼脂双扩散,试管凝集反应及间接血球凝集试验进行抗原性研究结果证明,分离株与绵羊肺炎支原体标准株(y—98)具有共同抗原性。从而不仅首次确证了该地本病是由绵羊肺炎支原体所致,且对山羊和绵羊都具有很高的感染率和较强的致病性。     

马麝朊蛋白基因的克隆与原核表达

为了解马麝朊蛋白基因的结构特征和其细胞型朊蛋白的性质,应用分子克隆和DNA重组技术进行了马麝朊蛋白基因的克隆、序列分析及其原核表达.序列分析表明,马麝朊蛋白基因编码区是包含在单一外显子内的完整开放阅读框,全长为771 bp,与马鹿、白尾鹿以及乳牛和绵羊朊蛋白基因相比,核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分别为97.3%～98.1%和97.7%～98.8%,说明朊蛋白基因在同科和不同科的反刍动物间是保守的;成功构建了马麝重组朊蛋白(85～233 aa)原核表达栽体pGEX-MuPrP(85～233),并转化E.coli BL21(DE3),获得重组表达菌E.coli GST-MuPrP(85～233),该重组菌可产生预期大小约为42.4ku的融合蛋白GST-MuPrP(85～233),在优化表达条件下,可产生占细菌总蛋白量30%以上的融合蛋白,免疫印迹检测显示表达蛋白可与抗牛单克隆抗体4C11反应,表明该基因的各氨基酸突变并未影响其单抗4C11的识别表位.     

绵羊CD46基因的克隆及真核表达

为了研究绵羊CD46蛋白的功能,根据从GenBank数据库获得的绵羊CD46基因的部分cDNA序列设计引物,以绵羊外周血淋巴细胞总RNA为模板,应用RACE方法扩增了绵羊CD46基因的完整开放阅读框序列,利用生物信息学软件对CD46cDNA及CD46蛋白结构进行了预测分析。结果显示,绵羊CD46cDNA序列开放阅读框长1 083bp,编码由360个氨基酸残基组成的多肽,该多肽的理论分子质量为39ku,理论等电点为6.5。对该蛋白结构分析时发现,绵羊CD46第1~42位氨基酸残基为信号肽序列,共有5处N糖基化位点,4处蛋白激酶C磷酸化位点,5处Ⅱ-酪蛋白激酶磷酸化位点,7处N-豆蔻酰化位点。二级结构中无α螺旋,β折叠占26.1%,其余73.9%为转角,该蛋白具有4个结构域,与人源CD46的同源性较高。同时将CD46基因克隆到pCMV-Myc载体中,构建了真核表达质粒pCMV-Myc-CD46;将构建的重组质粒转染哺乳动物细胞CHO-K1以进行瞬时表达。Western-blot结果显示,CD46基因在真核细胞中成功获得了表达。上述研究结果为以后开展绵羊CD46的功能研究奠定了基础。     

山羊支原体山羊肺炎亚种M17基因的原核表达及细胞定位研究

为分析山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)氨基肽酶M17的特征及细胞定位。参照GenBank中Mccp M1601株的M17基因序列,优化密码子,合成原核表达载体pET30a-M17,将鉴定正确的表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导后获得融合表达蛋白;用其免疫新西兰兔,制备超免疫血清,并测定其效价和代谢抑制效果;通过Western-blot和i ELISA两种方法对M17在Mccp细胞内的分布进行了初步研究。结果显示,pET30a-M17重组蛋白在大肠杆菌中获得成功表达,大小约50 ku,与预期相符,密码子优化后的表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在;免疫后的兔血清抗体效价达1∶80 000以上,说明M17重组蛋白具有较好的免疫原性和反应活性;M17多抗血清对Mccp无代谢抑制作用,但能够与Mccp的膜蛋白、胞浆蛋白及全菌蛋白发生特异性反应,表明M17蛋白在Mccp的细胞膜和细胞质中均有分布,但细胞膜中含量略高于细胞浆。M17的成功表达以及在Mccp中的细胞定位为其生物学功能研究奠定了基础,也为山羊传染性胸膜肺炎的诊断和疫苗研制提供了参考。     

猪肺炎支原体抗原定量ELISA检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体抗原的快速检测方法,本研究以抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体为包被抗体,抗P46蛋白多克隆抗体为检测抗体,建立了猪肺炎支原体双抗体夹心ELISA方法。通过优化后的反应条件为:抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体包被浓度为2.5μg/mL,抗P46蛋白多抗及酶标二抗稀释度分别为1∶40 000和1∶10 000。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检出量为9.754 ng/mL,与猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体等无交叉反应。使用该ELISA方法对人工稀释的培养物中抗原含量进行检测,通过单点法和对样品倍比稀释后进行双平行线拟合两种方法计算,得出两种计算方法结果均与真实值基本相符,但双平行线法检测比单点法检测更加稳定。本研究建立的双抗体夹心ELISA方法为猪肺炎支原体的定量检测提供了有效手段,可用于猪支原体肺炎灭活疫苗生产过程中抗原的检测,为灭活疫苗生产中的质量控制提供了便利。     

新疆南疆部分地区绵羊支原体感染的分子流行病学调查

为了解新疆南疆地区规模化羊场支原体感染的流行情况,首先采用PCR技术对新疆南疆3个县的5个规模化羊场132例鼻拭子、6例肺样品进行初步检测;然后利用支原体液体培养基MTB及固体培养基MTA对PCR阳性样本进行分离培养、鉴定;并选取部分代表株,对其16S r RNA基因进行序列测定,分析其分子特征。PCR结果显示,该地区支原体总体阳性率为26.1%(36/138),绵羊肺炎支原体阳性率为14.5%(20/138),精氨酸支原体的阳性率为11.6%(16/138),其中库车县的支原体阳性率最高,达43.5%(27/62)。系统进化树显示:绵羊肺炎支原体分离株中,WSMO株与美国株的亲缘关系较近,其他分离株单独聚为一支;精氨酸支原体分离株中,YJSMA与南非株的亲缘关系较近,其他分离株单独聚为一支。这说明该地区菌株由于地理环境或长途运输导致与国外菌株的亲缘关系较近,同时存在一定程度变异造成基因型的差异。本研究结果可为该地区绵羊支原体病的有效防治提供参考。