小熊猫犬瘟热病毒感染的诊断

犬瘟热病毒在自然条件下主要感染犬科、鼬科和猫科多种动物 ,引起犬和多种经济动物、野生动物的一种急性、高度接触性传染病。 1994年Ａｐｐｅｌ等报道患病的浣熊为传染源引起美国加利福尼亚野生动物园包括豹、虎、狮在内的 17只大型猫科动物死于犬瘟热 ;伊利诺动物园和加利福尼亚某野生动物保护区也曾发生了由于犬瘟热病毒感染而引起野生动物死亡 ,并分离到了犬瘟热病毒 ;另有关统计表明在坦桑尼亚北部有 3 0 %的狮子死于犬瘟热[1] 。 1999年 3～ 5月 ,重庆动物园小熊猫暴发流行了一种急性传染性疾病 ,经采用先锋霉素、干扰素和犬瘟热、细…     

小熊猫等四种动物犬瘟热病毒的分离与鉴定

对犬、貂、貉、狐、熊、小熊猫、大熊猫、狼、狮、虎、金猫和猞猁共６５只动物的病料进行了犬瘟热病毒（ＣＤＶ）分离，结果从小熊猫、犬、貉和狐四种动物的病料中分离出９株ＣＤＶ，其中小熊猫ＣＤＶ具有较强诱导产生中和抗体的能力。该毒株有可能成为疫苗后备株。     

急性犬瘟热伴发寄生性肠炎的病理形态学观察

为从病理学方面调查急性犬瘟热与寄生性肠炎的关系,通过免疫组织化学、苏木精伊红和过碘酸雪夫氏染色等方法,对12例急性犬瘟热伴发腹泻的病例进行了病理组织学研究。结果表明,6例腹泻主要是由球虫引起的,2例由隐孢子虫所致。犬球虫主要存在于病犬的空肠和回肠黏膜的上皮细胞内,在脱落的肠上皮细胞和被破坏的肠绒毛所形成的黏液内,也能检出大量的球虫。最常见的球虫形态为滋养体和裂殖体,滋养体多位于上皮细胞内或细胞间,断面呈不整圆形,核位于中央,被苏木精深染,原生质淡染呈细网状,质膜明显;裂殖体多呈不整圆形,内有香蕉状的裂殖子,位于变性的肠上皮细胞内,含有较多的糖原颗粒,用过碘酸雪夫氏染色时呈红色。隐孢子虫主要位于肠上皮细胞和肠腺上皮细胞的纹状缘,引起微绒毛破坏和细胞脱落。用抗犬瘟热病毒核衣壳蛋白单抗染色检查,小肠黏膜上皮细胞、隐窝的腺上皮细胞、浸润在肠黏膜固有层的淋巴细胞、巨噬细胞和集合淋巴结的树突状细胞均呈强阳性反应。据此认为急性犬瘟热的寄生性腹泻是在犬瘟热病毒引起肠黏膜抵抗力降低的基础上发生的。     

大熊猫犬瘟热的快速诊断

大熊猫犬瘟热的快速诊断龙小海文传良陈小琴（重庆市兽医防疫站４０００４３）眼结膜拭片检查鳞状上皮细胞中的病毒包涵体，可快速简便而准确地确诊大熊猫犬瘟热。本法用于大熊猫犬瘟热诊断尚未见报道。１方法用灭菌脱脂棉签浸蘸生理盐水，在患病大熊猫眼结膜上稍用力擦拭...     

小熊猫接种犬瘟热疫苗后的抗体检

以犬用犬瘟热（ＣＤ）弱毒疫苗接种从产地新引入南京市玄武湖动物园的２只小熊猫（Ａ组），在接种后１１个月内每月采血１次，用微量中和试验检测其体内抗犬瘟热病毒（ＣＤＶ）抗体效价。结果显示，小熊猫接种后１个月时抗体效价已达１∶１０００左右，２个月时效价最高，达１∶２０００左右，而后缓慢下降，至７和１１个月时分别约为１∶１００和１∶２０。同时检测了以前接种过同一疫苗的３只该动物园自己繁育的小熊猫（Ｂ组）和福州市动物园内的６只小熊猫（Ｃ组）的ＣＤＶ中和抗体效价，其效价变化类似于Ａ组。这些小熊猫在接种前均确认健康，在试验期间同样的饲养条件下未发生ＣＤ，提示犬用ＣＤ疫苗可用于小熊猫的ＣＤ预防，其产生的有效免疫力至少可持续６个月。     

犬瘟热的诊治

当前 ,随着城市家庭养犬不断增多 ,犬瘟热 (ＣＤ)发病率呈上升趋势 ,且死亡率极高 ,据统计死于犬瘟热的犬可占全部死亡犬的 70 %。犬瘟热是由犬瘟热病毒 (ＣＤＶ)引起的一种传染病 ,其特征为破坏犬免疫系统 ,使机体抵抗力急剧下降 ,体质迅速衰弱 ,最后衰竭死亡。犬瘟热的临床症状复杂多样 ,初期表现为呼吸道和肠胃疾病 ,剖检可见肝、肾肿胀等病理变化 ,如不及时治疗 ,病毒可侵害大脑 ,逐渐出现抽搐等神经症状。1　流行病学本病多发于 3～ 10月龄的幼犬 ,哺乳期的仔犬由于可以从母乳中获得抗体 ,故很少发病。刚断奶的仔犬 ,由于要适应新环境 …     

犬瘟热病毒反转录环介导等温扩增诊断方法的建立

根据GenBank中犬瘟热病毒H基因保守序列设计合成了内(FIP,BIP)、外(F3,B3)2对引物,其中外引物扩增片段的大小为247 bp。通过对反应条件中内、外引物的比例、dNTP浓度、Mg2+浓度、反应温度和时间等条件逐一优化,成功建立了犬瘟热病毒的RT-LAMP检测方法。该方法在60℃下保温50 min即可完成,可检测至10-1TCID50的病毒,与常规RT-PCR检测方法相比灵敏度高100倍。对犬腺病毒、犬细小病毒、狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬瘟热病毒同时检测,结果显示,本方法具有高度的特异性。     

犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速检测犬瘟热病毒的诊断方法,根据GenBank中犬瘟热病毒核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对犬瘟热病毒最低检出量为80copies/μL,是常规RT-PCR的100倍;与其他犬类病毒不发生交叉反应;组内、组间变异系数均小于5%。对收集的67份临床样品进行检测,阳性检出率为64.2%,而常规RT-PCR的阳性检出率为44.8%。研究结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR具有良好的敏感性、特异性和稳定性,为犬瘟热的早期诊断提供了技术手段。     

犬瘟热病毒小熊猫株的驯化致弱及其免疫研究

犬瘟热病毒(CDV)小熊猫低代强毒(LPV9)经MDCK、CRFK和Vero细胞分别传至21、20、20代,并采用蚀斑技术对传代毒进行克隆.病毒每传20代进行1次致弱程度鉴定,结果表明LPV9随所传代数增加,对幼犬的致病性逐渐减弱,至第70代(LPV70)时,对接种犬失去了致病性.2个组犬按每只1×104TCID50,分别接种LPV70和疫苗弱毒复壮株R-20/8,14 d后前者刺激接种幼犬产生的中和抗体效价均大于1100的完全保护价,而后者则有低于1100的(攻毒保护率分别为5/5和4/5),故驯化致弱的LPV70免疫原性要好于疫苗弱毒复壮株R-20/8.将LPV70分别在细胞上连续20代、在幼犬连续传代5代后,其细胞培养物及从动物体内回收的病毒免疫原性及安全性能够稳定遗传.     

小熊猫绿脓杆菌病的诊断

小熊猫 (Ａｉｌｕｒｕｓｆｕｌｇｅｎｓ)属食肉目浣熊科动物 ,主要产于我国西南地区 ,属国家二类保护动物 ,具有较高观赏价值。 1999年 1月 15～ 2 2日 ,成都动物园饲养的 3只小熊猫先后发病 ,经系统检查确诊为绿脓杆菌病 ,但所表现的临床症状及药物敏感试验结果均与以前曾报道的小熊猫绿脓杆菌病有所差异。1　临床症状病初表现为精神沉郁、食欲不振 ;继而表现眼结膜潮红、充血 ,无眼屎 ,由于口鼻分泌物增多 ,两前肢不断磨擦口鼻部 ;随后精神极度沉郁 ,头颈僵直 ,行走时后肢无力 ,左右摇摆 ,呼吸急促 ,呈典型腹式呼吸 ,并很快发展为阵发性痉…     

犬瘟热病毒SD(14)7株对比格犬的致病性研究

对3~4月龄比格犬经肌肉注射方式接种犬瘟热病毒(CDV)SD(14)7株1 mL(病毒含量为106.0 TCID50/mL),并进行体温、淋巴细胞数、眼鼻直肠排毒和组织病毒含量及分布等指标检测,评价变异株SD(14)7对比格犬的致病水平。结果显示,CDV感染后第2天比格犬出现CDV感染的典型特征,如眼和鼻分泌物增多,淋巴细胞明显减少,然而动物的体温变化无明显的“双相热”特征。CDV定量检测结果显示,比格犬攻毒后第10天开始通过眼鼻和直肠向外界排毒,CDV在脾中含量最高。病理剖检可见脾有坏死、肺炎症出血等,病理组织HE和免疫组织化学检测发现脾有严重的充血,淋巴细胞中有CDV抗原,证实该毒株主要感染淋巴组织和器官。此外,比格犬大脑部分神经细胞严重肿胀,在脑中可检测到CDV,表明SD(14)7株具有一定的神经嗜性。本试验结果为进一步鉴定犬瘟热病毒感染比格犬的毒力因子和免疫原性以及疫苗免疫效果的评价奠定了基础。     

犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-PCR的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。     

犬瘟热病毒TN野毒株核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的犬瘟热病毒(CDV)Onderstepoort株核蛋白基因(N)序列,设计了1对特异性引物,用该引物对分离的TN野毒株进行了RT PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM T质粒连接,得到重组质粒pTN。经核苷酸序列测定,CDVTN株N基因的ORF全长1569bp,编码523个氨基酸;将TN野毒株与GenBank中收录的其他CDV毒株进行比较,N基因核苷酸序列的同源性为94%～99%,推导的N蛋白氨基酸序列的同源性为97%～99%。TN株与Onderstepoort疫苗株氨基酸序列的差异主要集中在N端(17～159位)和C端(408～519位),中间的区域则高度保守。此外,在CDVN蛋白N端281～289位上也发现存在与麻疹病毒(MV)N蛋白完全相同的Y P A L G L H E F9肽序列,推测可能是诱导CTL活性的靶蛋白的抗原表位之一。氨基酸组成分析发现,推导的N蛋白氨基酸序列中亮氨酸、丝氨酸和异亮氨酸所占比例很高,提示该蛋白具有高度螺旋和缠绕的分子结构。     

大熊猫IgG Fc HRP酶标二抗的制备

为获得辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗大熊猫Ig G抗体,本研究利用重组大肠杆菌表达技术对大熊猫Ig G Fc片段进行了表达,获得重组蛋白后进行了小鼠免疫,抗体特异性检测,并进行了多克隆抗体的HRP标记。结果显示,在37℃、IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导5 h的条件下,可获得分子质量约为88 ku的目的蛋白;将重组蛋白免疫小鼠后,免疫小鼠血清与重组蛋白反应效价可达1∶102400以上,且与大熊猫血清Ig G反应良好,经HRP标记试剂盒标记的鼠抗大熊猫Ig G效价可达1∶25600以上。上述结果表明,本研究成功制备了HRP标记的小鼠抗大熊猫Ig G二抗,为大熊猫疾病血清学检测方法的开发提供了支撑。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白基因序列,设计合成了1对特异性引物,以CDV疫苗株ONP为模板,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测CDV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RT-PCR扩增,能得到与理论设计值大小一致的242bp的特异性条带;该方法最低可以检测出约20pg含量的CDV;对已知CDV阳性和阴性病料进行重复性和稳定性试验,结果均一致;用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)和同为副黏病毒科的新城疫病毒(NDV),均无交叉反应;对32份临床病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测试纸检测结果进行比较,符合率为93.75%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,重复性和稳定性均好,可用于犬瘟热病毒的临床诊断和试验研究。     

犬瘟热病毒R/20-8株核衣壳蛋白基因的克隆和表达

应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒(CDV)核衣壳(N)蛋白基因的高度保守序列,将其克隆至质粒pMD18-T中,获得了重组质粒pMD18-T-N。将N基因的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE电泳和Western-blot分析结果显示,表达产物的分子质量为55 ku,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。表明,大肠杆菌表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有一定的相似性,可作为诊断用抗原。     

甘肃犬瘟热病毒流行株N蛋白和H蛋白基因的序列分析

采用RT-PCR方法扩增了3株犬瘟热病毒(CDV)分离株的N、H蛋白基因,将其克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析。结果表明,获得的N蛋白基因序列与GenBank上登录的其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为92.5%～99.9%,获得的H蛋白基因与其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为81.7%～100%。由N蛋白基因和H蛋白基因推导的氨基酸序列构建的遗传进化树可知,这3株CDV流行株均处于野毒株的分支上,在N蛋白基因的遗传进化树上,CDV流行株呈现明显的地域性差异,而在H蛋白基因的遗传进化树上,不同国家和地区的CDV分离株之间虽有一定的地域联系,但与N蛋白基因相比,其地域性联系并不明显。说明这3株CDV流行株为野毒株,H蛋白基因的变异水平明显高于N蛋白基因,而N蛋白基因更能显示毒株与地域的关系。     

金丝桃素可溶性粉体外抗犬瘟热病毒的试验研究

采用先药后毒、先毒后药和药毒同加3种不同的给药方式,分别在试验开始后第72 h和96 h观察犬瘟热病毒致Vero细胞的病变情况.结果显示,犬瘟热病毒的TCID_(50)为10~(-5.68)/0.1 mL,药物的TC_0为0.312 5 g/L;与对照组比较,药物浓度在0.039～0.312 5 g/L范围内先毒后药方式的细胞生长情况良好,细胞单层完整,视野中有极少量圆细胞或死细胞,而其余两种给药方式的细胞病变明显.结果表明,金丝桃素可溶性粉在先毒后药情况下可以有效抑制犬瘟热病毒的增殖.     

禽骨髓细胞瘤病自然病例的病理学研究

对禽骨髓细胞瘤病显性型病鸡、ELISA阳性的隐性型病鸡和阴性对照鸡进行了病理学研究。结果表明 ,临床症状明显的显性型病鸡肝、脾、肾、睾丸 (或卵巢 )、肺等组织有灰白色结节状病灶和不同程度的肿胀 ,甚至在股骨或肋骨等处出现大小不一的硬固肿块 ,镜检病变部位有大量髓细胞样瘤细胞 ,呈典型的骨髓细胞瘤病的病理特征。电镜下瘤细胞病变明显 ,瘤细胞胞膜下疑似病毒样粒子 ;在自然病例肾悬液感染的鸡胚成纤维细胞培养物中巨噬细胞的膜性结构上发现增殖的病毒样凸起。ALV JELISA抗体检测试剂盒检出阳性、无明显临床症状和眼观病变的隐性型病鸡 ,光镜下骨髓、肝、卵巢、心肌等组织中可见与显性型相同的髓细胞样瘤细胞 ,但数量较少。ELISA抗体检测阴性对照鸡骨髓中胞浆含有嗜酸性颗粒的髓细胞明显少于阳性鸡 ,除在肝、卵巢等组织中偶尔出现外 ,其他组织很少见到。