猪血清中牛病毒性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

为建立检测猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的ELISA方法,经ELISA反应条件优化、特异性试验、重复性试验及与中和法、IDEXX ELISA对比试验建立了特异性ELISA。用此方法对福州市周边20个猪场的222份猪血样进行了BVDV抗体检测。结果显示,本ELISA反应条件为:BVDV Oregon C24V与NADL株联合包被(质量浓度均为31.25μg/L,每孔加50μL)的条件为37℃1h加4℃8h,家兔抗猪瘟病毒(CSFV)超免疫血清(每孔血清效价可中和400RID CSFV)阻断时间为2.0h,封闭剂和血清稀释液中NaCl的浓度和Tween-20的体积分数分别为0.7mol/L和3.00mL/L,100mL/L马血清封闭剂、1∶50稀释的待检血清、0.625 mg/L HRP-家兔抗猪IgG酶标二抗(100μL/孔)及底物的反应时间分别为2.0、0.5、0.5h及15min;检测CSFV、伪犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均为阴性;4份血样进行5次板内、板间重复试验结果均一致;参照中和试验,本ELISA方法的符合率(97.9%)高于IDEXX BVDV ELISA抗体检测试剂盒(93.8%);福州市周边猪群BVDV抗体阳性率为34.7%,猪场阳性率为80.0%,其中母猪群阳性率(44.6%)高于商品猪群(26.4%)。结果表明,本ELISA方法特异性强、符合率高、重复性好,适合用于猪源BVDV的血清学监测。     

南京市初生犊牛病毒性腹泻-黏膜病血清学调查

应用血清中和试验,检测南京市部分奶牛场初生犊牛血清中牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)抗体.共检测血清3 070头份,其中阳性797头份,占25.96%;检测混合血清274批,其中阳性172批,占62.77%;同时随机测定459头份阳性血清的抗体效价,多数为18～164,最高的达到1128.     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其特性研究

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因疫苗和重组E2蛋白分别免疫BALB/c小鼠,制备了5株单克隆抗体(4G3、3B2、3F8、2H6、3A11),并对这些单克隆抗体的亚类、免疫原性及其与瘟病毒的反应性进行了检测.结果显示,4G3、382、3F8、2H6为IgM类抗体,3A11为IgG类抗体;纯化后的单克隆抗体与纯化前比较,与抗原的反应性略有提高;5株单克隆抗体与BVDV和猪瘟病毒(CSFV)均有交叉反应性.表明,制备的5株单克隆抗体所针对的是BVDV和CSFV共有的抗原表位.     

牛病毒性腹泻病毒E_(84-170aa)~(rns)蛋白的可溶性表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的ELISA方法,对E~(rns)蛋白一个包含2个预测抗原表位的96氨基酸蛋白编码序列,经密码子优化后进行基因合成,构建重组表达载体pET-E_(84-170aa)~(rns),转化表达菌株BL21(DE3),在28℃用0.1 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达。将重组E_(84-170aa)~(rns)蛋白通过Ni~(2+)-NTA树脂亲和层析方法纯化后,用Western-blot分析其抗原性。结果显示,重组E_(84-170aa)~(rns)蛋白以完全可溶形式在大肠杆菌中高效表达,经Ni~(2+)-NTA树脂纯化获得重组E_(84-170aa)~(rns)蛋白的浓度和纯度分别为1.5 mg/mL和94%。Western-blot显示,该重组蛋白对BVDV阳性血清具有很强的抗原反应性。用纯化的重组E_(84-170aa)~(rns)蛋白建立间接ELISA方法(E_(84-170aa)~(rns)-iELISA)的结果显示,所建立方法的最佳抗原包被浓度为1.0μg/mL,血清稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶5 000,血清D450的阴阳性临界值为0.283;该方法仅对BVDV阳性血清呈特异性反应,对1∶1 280倍稀释的阳性血清仍可检出,批内试验和批间试验的变异系数均小于10%。用该方法对487份牛血清进行BVDV抗体检测,检出128份阳性血清。本研究建立的E_(84-170aa)~(rns)-iELISA方法为BVDV抗体检测及流行病学调查提供了一种有效手段。     

浙江省规模化养猪场猪生殖和呼吸系统综合征的血清学调查

应用ELISA方法 ,对浙江省杭州、嘉兴、宁波、绍兴、金华、衢州、丽水和舟山 8个地区的 1689份血清进行了PRRSV抗体检测。结果表明 ,血清PRRSV抗体平均阳性率为 3 1.91% ,其中 1999、2 0 0 0和 2 0 0 1年抗体阳性率分别为 11.64 %、18.47%和 46.86% ,逐年提高 ;以地区统计 ,2 0 0 1年嘉兴地区猪血清PRRSV抗体阳性率最高 ,达 73 .61% ,而宁波最低 ,为 2 2 .86% ;以生猪类型统计 ,母猪、公猪、育肥猪和断奶仔猪 2 0 0 1年血清PRRSV抗体阳性率分别为 49.69%、42 .86%、5 1.5 6%和 2 8.83 %。     

规模化猪场猪圆环病毒2型感染的血清学调查

用ELISA方法对甘肃省酒泉、张掖、武威、兰州、临夏、白银、定西 7市 (州 )及青海省大同地区的 12个规模养猪场或个体养殖户送检的 2 19份猪血清进行了猪圆环病毒 2型 (PCV2 )抗体检测。结果 ,抗体阳性血清 12 8份 ,其中母猪血清 75份 ,仔猪血清 5 3份 ;总抗体阳性率为 5 8.4 5 % ,母猪抗体阳性率为 6 3.2 5 % ,仔猪抗体阳性率为 5 2 .94 % ;同时对张掖市及大同地区的猪场进行了跟踪调查 ,张掖市 2、3、4和 6月份的阳性率依次为 12 .5 0 %、4 2 .11%、75 .0 0 %和 97.4 2 % ,青海大同地区 4月份和 8月份的阳性率依次为 12 .5 0 %和 85 .71%。表明两地的PCV2感染率随气候变暖而呈明显上升的趋势。     

陕西省猪伪狂犬病血清学调查

2000年1-3月份,在陕西省11个地区(市)的59个县(市)对7458份种猪血清进行了猪伪狂犬病抗体乳胶凝集试验.共检出抗体阳性血清1394份,阳性率为18.69%.对其中44个县(市)的5089份血清进行了详细统计,母猪的血清抗体阳性率为14.85%(544/3662),公猪的血清抗体阳性率为18.81%(120/638),后备母猪的血清抗体阳性率为20.43%(141/690),后备公猪的血清抗体阳性率为28.28%(28/99).     

牛病毒性腹泻病毒荧光标记单克隆抗体的制备及鉴定

为制备可以区分牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因型的荧光标记单克隆抗体,分别利用分泌抗牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒(BVDV-Ⅰ)、牛病毒性腹泻Ⅱ型病毒(BVDV-Ⅱ)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-Ⅰ和BVDV-Ⅱ)单克隆抗体的杂交瘤细胞株BV1、BV2、BV12,腹腔接种BALB/c小鼠,大量制备单克隆抗体,用辛酸-硫酸铵法提纯,经活性、浓度、纯度检测合格后,利用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联,制备成3种荧光标记单抗。结果显示,3种标记单抗的F/P比值范围均在2.0～4.0之间;细胞DFA法测定其效价均≥1∶200;抗原交叉试验证实标记单抗的特异性良好;标记单抗可以检测到1TCID50的病毒粒子;临床初步应用表明,3种标记单抗的阳性检出率均≥95%,与进口BVDV荧光抗体的符合率为100%。3种荧光抗体的研制对BVDV基因分型鉴定、NCP型BVDV的鉴定以及BVDV与CSFV的鉴别诊断有很好的应用价值,值得进一步开发。     

浙江省规模化猪场猪瘟免疫状况监测

应用正向间接血凝试验分别检测了46个规模化猪场1075头母猪、9个规模化猪场198头育肥猪、4个规模化猪场72头断奶前仔猪和13个规模化猪场296头断奶后仔猪血清的猪瘟抗体效价.结果,母猪、育肥猪、断奶前仔猪和断奶后仔猪分别有149、65、3和110份血清抗体效价≤1∶8,低于临界保护线;分别有926、133、69和186份血清抗体效价≥1∶16,视为免疫合格,免疫合格率分别为86.17%、67.17%、95.83%和62.84%,检测结果表明,断奶后仔猪和育肥猪免疫效果不理想.     

猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株3′非编码区的克隆及结构分析

为了研究猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)SD0803株3′非编码区(3′-UTR)的结构及其在病毒复制与转录中的作用,采用病毒RNA 3′末端加Poly(A)尾的方法与3′RACE技术对SD0803株3′末端序列进行了扩增、克隆与测序,并应用Clustal W、CLC RNA Workbench 4软件对3′-UTR一级与二级结构进行分析。结果表明,SD0803株3′-UTR由186nt组成,与ZM-95、NADL、SD-1株核苷酸同源性分别为85.4%、53.8%、57.5%;SD0803与其他BVDV株一样,其一级结构均存在1个高变区与1个相对保守区;在高变区缺失约40nt;在RNA 3′末端二级结构方面,SD0803株与ZM-95株均具有3个茎-环结构,而与具有4个茎-环结构的牛源BVDV差异较大。