含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3''''非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列.测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基.经与参考毒株进行序列比较,结果显示, HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%.同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较.结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域.     

含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3′非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基。经与参考毒株进行序列比较,结果显示,HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%。同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较。结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域。     

牛病毒性腹泻病毒基因1型全基因组的测序分析

以我国新疆地区分离的1株牛源牛病毒性腹泻病毒基因1型毒株为研究对象,参照GenBank中的牛病毒性腹泻病毒1型基因组全序列,根据保守序列设计6对重叠引物,通过RT-PCR扩增出该毒株不同的cDNA片段,分别克隆到pMD19-T载体,转化受体菌JM109,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及测序分析,为了解该毒株的遗传变异及基因结构与生物功能的关系,为开发牛病毒性腹泻病毒新型疫苗奠定基础。测序结果表明,该病毒全基因序列核苷酸为12 302nt(GenBank登录号:JN704144),该病毒基因组具有一个11 694nt开放阅读框编码的多聚蛋白,5′-UTR长382nt,3′-UTR长224nt,BVDV1-3156的全基因组序列分析发现该毒株为BVDV1b亚型。Blast比对分析显示,该毒株与VEDEVAC株的相似性最高,为90.9%。该毒株与BVDV1型其他毒株的全基因组序列具有较大的差异。     

通用型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是牛的主要病原之一,对全球养牛业造成了巨大的经济损失。本文根据GenBank中BVDV基因组中5′-UTR序列合成引物,建立了同时检测BVDV两个基因型的RT-PCR方法。结果显示,所建方法具有较强特异性和敏感性,可扩增出长约300 bp的特异性片段,最低检测限量为6.8×10~3copies/μL。用该方法对30份临床样品进行病原检测,结果显示,BVDV阳性样品4份,阳性率为13.33%。对阳性PCR产物测序及序列分析的结果表明,该牛病毒性腹泻病毒流行株属于BVDV-2型。3份阳性样品SD3、NM26、NM29与国内流行株新疆XJ-04亲源关系最近,相似度达96.9%。本研究建立的通用型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,可用于临床上牛病毒性腹泻病毒的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株全基因组分子特征分析

利用RT-PCR方法扩增得到猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)HN-HW分离株全长基因组的17个片段。拼接后发现该毒株基因组全长为15 334nt(包括poly A尾巴),与国内外14株美洲型PRRSV分离株全序列相似性介于85.3%～99.4%之间,而与欧洲型PRRSV Lelystad Virus(M96262)和SD01-08(DQ489331)分离株全序列相似性仅为59.7%和59.9%。序列分析表明,该毒株包括189nt的5′UTR,14 981nt的蛋白编码区和150nt的3′UTR及14nt的poly(A)尾巴。同美洲标准株ATCC VR-2332相比,Nsp2存在30个氨基酸的缺失。本研究结果补充了PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

口蹄疫病毒Asia 1/JSWX株基因组全长感染性克隆的体外拯救与序列分析

通过反转录聚合酶链反应,获得了口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JSWX株基因组3′端长片段(长约7.5kb)和5′UTR中ploy(C)前后的2个短片段。5′UTR的2个短片段经融合PCR扩增得到长约710bp的片段。用引物在基因组5′末端引入AflⅡ酶切位点和T7启动子,在5′UTR内引入SpeⅠ酶切鉴定位点,在3′末端引入NotⅠ酶切位点,将融合片段和3′端长片段顺次连接到载体pSL1180。经T7体外转录系统获取的RNA转录本与脂质体共转染BHK21细胞。测序结果表明,构建的病毒基因组全长cDNA为8 197nt,分别包括1个长为1 095nt的5′UTR[含有1个17nt的ploy(C)];1个长6 990nt的ORF;1个长为93nt的3′UTR;之后是18nt的poly(A)尾巴。该全长cDNA克隆与Asia 1/Jiangsu/China/2005株基因组序列的同源性为98.4%。测序和酶切鉴定结果均表明,该口蹄疫病毒株全长cDNA克隆已构建成功,该方法极大地简化了获得FMDV全长cDNA克隆的过程。通过反转录聚合酶链反应、间接免疫荧光试验和蚀斑试验等鉴定,本试验获得了感染性分子克隆;体外拯救获得的基因工程病毒连续传代培养后,可致BHK21细胞产生病变。上述结果表明,构建的cDNA克隆可以作为基因操作的载体,为深入研究安全性好、稳定性高和免疫原性强的基因工程疫苗奠定了基础。     

瘟病毒非结构蛋白的结构和功能

猪瘟病毒 (CSFV)、牛病毒性腹泻病毒 (BVDV )和边界病病毒 (BDV)均为黄病毒科 (Flaviviridae)瘟病毒属 (Pestivirus)的成员[1] 。它们在结构、抗原性和遗传上关系密切。据推测CSFV、BVDV和BDV是由一个共同的祖先为适应不同动物演变而来。BVDV和BDV可感染反刍动物和猪 ,CSFV仅感染猪。瘟病毒属成员均为小的、有囊膜的、单股正链RNA病毒。病毒基因组长约 12 .312 .5kb。CSFV基因组为单股正链RNA ,长约 12 .3kb ,包括一个 5′非翻译区 (5′UTR) ,一个编码 4种结构蛋白 (C、Erns、E1和E2 )和 8种非结构蛋白 (Npro、p7、NS…     

猪源乙型脑炎病毒HEN0701株全基因组的分子特征

将乙型脑炎病毒HEN0701株基因组RNA分4段进行RT-PCR扩增,并克隆入pCRⅡ-Blunt-TOPO载体中,测定全长cDNA序列。以MapDraw软件分析了乙型脑炎病毒HEN0701株的基因组结构,并将病毒基因组分成2个非编码区和10个基因,比较了HEN0701株和11株乙型脑炎病毒在全基因组和各基因的核苷酸及推导氨基酸的同源性。以MEGA5软件绘制HEN0701株和11株病毒C、E、NS3、NS5基因的进化树。结果显示,HEN0701株全基因组为10 965 nt,包含一长10 299 nt的开放阅读框。在核苷酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株的全基因组和各基因的同源性均高,而与GⅢ分离株则较低;而在氨基酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株在多聚蛋白和各病毒蛋白的同源性和HEN0701株与GⅢ分离株的相近。进化分析显示,不同基因进化树的拓扑结构相近,12株病毒的C、E、NS3、NS5基因进化方向相同,GⅠ分离株和GⅢ分离株间C基因进化距离最近。     

IBV疫苗株基因组3''''末端序列分析

以5株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)疫苗株(D41、H120GD、H120SH、H52BJZH和H52GD株)和IBV标准强毒M41-E4株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出1条特异性条带,包括部分核衣壳蛋白(N)基因以及紧接着N基因下游的基因组3′端非编码区(UTR).测序结果表明,从D41、H120GD和H120SH株扩增的特异性片段长度为614 bp;而从H52BJZH、H52GD和M41-E4株扩增的特异性片段长度为406 bp.序列分析发现,被检的6株IBV毒株可分两组,其中D41、H120GD和H120SH株为一组,核苷酸序列同源性为99.7%～99.8%;而H52BJZH、H52GD和M41-E4株构成另一组,其核苷酸序列同源性为99.3%～100%;两组之间的最大同源性仅为94.6%.在系统发生进化树上,这两组分别位于不同的分支簇上,国内的H52BJZH、H52GD与国外的H52株不在同一分支簇上,相反却与国内强毒M41-E4株以及国外M41株在同一分支簇上.提示国内H52疫苗株与国外H52疫苗株不同,它们在亲缘关系上更靠近M41-E4株和M41株.     

猪源牛病毒性腹泻病毒1型分离株的鉴定及培养特性研究

利用RT-PCR方法从猪场腹泻样品中检测到牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核酸阳性样品,测序证实为1型BVDV,命名为SHCM06。遗传进化分析表明,其与ZM-95亲缘性最近,同源性达98.3%;与BVDV-1经典毒株亲缘性较远,仅85.7%~89.8%。免疫荧光、Western-blot和荧光定量RT-PCR检测均表明,SHCM06毒株可感染MDBK、ST和PK15细胞,在MDBK和ST细胞上的增殖效率显著高于PK15细胞。进一步分析SHCM06感染对细胞中Ⅰ型干扰素表达的影响,结果显示,SHCM06感染均能使3种细胞中IFN-α和IFN-β表达量显著下降(P0.05),且对MDBK细胞IFN-α的抑制效果显著高于对PK15细胞中IFN-α的抑制作用(P0.05)。结果表明,从猪临床腹泻样品中分离1株BVDV1型,该病毒对MDBK、ST细胞适应性好于PK-15细胞,能显著抑制细胞中Ⅰ型IFN的产生,以发挥抵抗细胞抗病毒免疫效应,本试验为深入研究猪源BVDV的致病作用奠定了基础。     

牦牛MBL2基因3′-UTR区抗菌相关SNPs的筛选

为了筛选牦牛MBL2基因3′-UTR区与抗菌有关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),本研究通过扩增青藏高原521头牦牛血液中MBL2基因3′-UTR区,并分别进行测序,利用DNAMAN8.0、CHROMAS 2.6.6和Haploview软件对序列进行SNPs预测和连锁不平衡分析,使用ELISA检测试剂盒分别检测血清中多杀巴氏杆菌和布氏杆菌抗体D_(450)值,利用SPSS分析SNPs与多杀性巴氏杆菌和布氏杆菌血清抗体D_(450)值的相关性,并通过miRWalk和RNA 22数据库对靶向牦牛MBL2基因3′-UTR区的miRNAs进行预测筛选。结果显示,牦牛MBL2基因3′-UTR区SNP大小为861 bp,预测存在A997C、T1295C、A1473T、C1511T和C1540T共5个SNPs,其中A997C和T1295C、A1473T和C1540T位点强连锁不平衡,A997C/T1295C位点CC/CC基因型与多杀性巴氏杆菌抗体D_(450)值的相关性显著高于AA/TT基因型和AC/TC基因型(P0.05);共预测到223个靶向牦牛MBL2基因3′-UTR区的miRNAs,其中12个miRNAs分别靶向T1295C、A1473T、C1511T和C1540T位点。结论,牦牛MBL2基因3′-UTR区A997C/T1295C位点多态性可能与牦牛抗多杀性巴氏杆菌性状具有相关性,12个miRNAs可能通过靶向T1295C、A1473T、C1511T和C1540T位点参与牦牛MBL表达水平调节。     

牛病毒性腹泻病毒长春分离株P125基因的克隆与序列测定

以MDBK细胞培养致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NCD毒株,采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA,并根据BVDV NADL参考株序列设计合成的1对引物(W1与W2),进行反转录PCR(RT-PCR),扩增出P125基因区约400bp的片段.经pGEM-T载体连接后克隆、测序,并与已发表的NADL、Osloss、SD-1、184、D、H、Yak等BVDV毒株序列进行比较.结果表明NCD株P125基因区无插入或缺失变异,但存在着核苷酸的替换;经聚类分析初步认为NCD株属于Ⅰa型.NCD株与长春184、H株核苷酸序列差异较大,而亲缘关系较近,表明BVDV在同一地区存在不同进化来源的毒株.     

口蹄疫病毒基因组IRES和Poly(C)之间功能未知区一级和二级结构分析

用RT-PCR法,以口蹄疫病毒(FMDV)WH/99株牛舌水泡皮为材料,提取RNA及扩增目的cDNA,然后与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株,再经重组质粒电泳、PCR和EcoRⅠ酶切鉴定;用DNAstar软件比较功能未知区的序列差异,以RNAdraw软件分析它们的二级结构.结果表明,7株FMDV的功能未知区序列长度介于207-256个核苷酸;序列分析表明,WH/99与AsiaⅠ 63/72、A24/Cruzeiro、TWTY/97和TWCP/97的序列差异最大,预示此区段可能与病毒感染嗜性有关;二级结构分析表明,A24/Cruzeiro、Asia Ⅰ 63/72和TWCP/97均有5个结构域,WH/99和TWTY/97具有6个结构域.TWTY/97和TWCP/97二级结构的差异可能是TWTY/97功能未知区第20位插入的"C"所致,而O1K/66和O1Campos仅有3个结构域.2株猪O型FMDV功能未知区5′端存在着连续的核苷酸缺失现象,最多达52个,唯有3株牛O型FMDV(O1K/66、O1Campos和WH/99)在上述位置无任何缺失.     

驯鹿β-防御素-1 cDNA 3''''末端的克隆及序列分析

为进一步研究驯鹿β-防御素-1(reBD-1)基因的分子结构,利用已克隆出的reBD-1部分片段,设计了1条特异性上游引物,并以反转录引物中的部分序列即3 sites Adaptor Primer作为下游引物,采用3′RACE技术成功克隆了reBD-1 cDNA的3′末端序列.通过与已知reBD-1片段拼接,得到了192 bp的完整开放读码框(ORF)、终止密码子TAA、118 bp的3′非翻译区(3′UTR)以及poly(A)15,其中ORF编码具有64个氨基酸残基的reBD-1前原肽.     

驯鹿β-防御素-1 cDNA3′末端的克隆及序列分析

为进一步研究驯鹿β-防御素-1(reBD-1)基因的分子结构,利用已克隆出的reBD-1部分片段,设计了1条特异性上游引物,并以反转录引物中的部分序列即3 sites Adaptor Primer作为下游引物,采用3′RACE技术成功克隆了reBD-1 cDNA的3′末端序列。通过与已知reBD-1片段拼接,得到了192 bp的完整开放读码框(ORF)、终止密码子TAA、118 bp的3′非翻译区(3′UTR)以及poly(A)15,其中ORF编码具有64个氨基酸残基的reBD-1前原肽。     

IBV疫苗株基因组3′末端序列分析

以 5株鸡传染性支气管炎病毒 (IBV )疫苗株 (D41、H12 0GD、H12 0SH、H5 2BJZH和H5 2GD株 )和IBV标准强毒M 41E4株的基因组RNA为模板 ,利用RTPCR技术 ,扩增出 1条特异性条带 ,包括部分核衣壳蛋白 (N)基因以及紧接着N基因下游的基因组 3′端非编码区 (UTR)。测序结果表明 ,从D41、H12 0GD和H12 0SH株扩增的特异性片段长度为6 14 2bp ;而从H5 2BJZH、H5 2GD和M 41E4株扩增的特异性片段长度为 40 6 2bp。序列分析发现 ,被检的 6株IBV毒株可分两组 ,其中D41、H12 0GD和H 12 0SH株为一组 ,核苷酸序列同源性为 99.7?.8%;而H5 2BJZH、H5 2GD和M 41E4株构成另一组 ,其核苷酸序列同源性为 99.3 0 %;两组之间的最大同源性仅为 94.6 %。在系统发生进化树上 ,这两组分别位于不同的分支簇上 ,国内的H5 2BJZH、H5 2GD与国外的H5 2株不在同一分支簇上 ,相反却与国内强毒M 41E4株以及国外M 41株在同一分支簇上。提示国内H5 2疫苗株与国外H5 2疫苗株不同 ,它们在亲缘关系上更靠近M 41E4株和M 41株。     

猪瘟标记疫苗的研究进展

猪瘟 (Classicalswinefever ,CSF)是世界范围内猪的最严重的疾病之一 ,因而被OIE列为A类传染病 ,其病原为猪瘟病毒 (CSFV)。CSFV是黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属 (Pestivirus)中的 1个成员 ,属有囊膜的RNA病毒 ,基因组为单股正链RNA ,含有 1个大的开放性阅读框 (openreadingframe ,ORF) ,ORF两侧分别是 5′ 非翻译区 (5′ UTR)和3′ 非翻译区 (3′ UTR)。CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由ORF所编码 ,翻译成 1个含 3898个氨基酸的多聚前体蛋白 ,这一大型前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异的蛋…     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Myanmar株全基因序列的测定与遗传变异分析

2010年首次从缅甸某发病猪场采集的疑似猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and re-spiratory syndrome,PRRS)病料中分离到一株PRRSV,命名为PRRSV Myanmar株。应用RT-PCR方法分段扩增出Myanmar株的各基因片段,并将扩增产物分别连接到pEASY-T3载体并进行测序。序列测定结果表明,Myanmar株基因组全长15 411bp(不包括PolyA尾),包含10个开放阅读框,5′UTR长189nt,3′UTR长151nt。全基因序列与经典PRRSV VR2332株核苷酸序列的一致性为99.3%,与高致病性PRRSV NVDC-JXA1株核苷酸序列的一致性为89.5%。在非结构蛋白Nsp2区域并未出现特征性的30个氨基酸的缺失,而与欧洲型标准毒株(LV)核苷酸序列的一致性为54.6%。上述结果说明Myanmar株在基因型上属于经典美洲型。同时,遗传进化树分析显示,Myanmar株与PRRSV 01NP1.2株、RespMLV株、BJ-4株及PL97-1株的亲缘关系最近。     

一株猪源1型呼肠孤病毒的分离及鉴定

为了研究猪呼肠孤病毒的分子生物学特性,通过在细胞培养液中添加胰酶的方法,从仔猪腹泻粪样中分离、纯化并鉴定了1株能在Vero细胞上稳定产生细胞病变,以细胞颗粒增多、肿胀、漂落等细胞病变为主要特征的猪源1型呼肠孤病毒SHR-A株。根据呼肠孤病毒的理化特性,对病毒进行初步纯化,然后进行电镜观察、核酸提取、RNA电泳、RT-PCR、各病毒基因扩增和克隆测序等常规病毒学鉴定。SHR-A株S1基因的同源性分析和核苷酸系统发育进化树分析表明,该病毒与哺乳动物呼肠孤病毒血清1型的同源性较高,而与血清2型和3型的同源性较低,因此初步判断该SHR-A株为血清1型,为国内首次报道从猪体内分离到血清1型的呼肠孤病毒。进一步分析发现,SHR-A的S1基因全长为1 465bp,其3′-UTR为3型,其余部分则为1型,说明其S1基因是1型和3型的嵌合体,此结果表明,哺乳动物呼肠孤病毒作为RNA病毒,基因重组可能是其除基因突变和基因重排以外的第3种病毒变异进化的重要方式。     

鸭坦布苏病毒AH-F10株全基因组的分子克隆与序列分析

为了解鸭坦布苏病毒安徽分离株AH-F10的分子特征,利用RT-PCR方法对其全基因组序列进行了克隆,并将全基因组及其推导的氨基酸序列与参考毒株进行序列比对及系统进化分析。结果显示,毒株AH-F10的全基因组序列长10 990nt,含有1个大的阅读框架,两侧各有一个非编码区(Untranslation region,UTR)。序列比对结果表明,AH-F10株与13株参考毒株的基因编码区具有较高的氨基酸序列同源性,其中与江苏JS2010株的同源性最高,达98%。研究还发现,鸭坦布苏病毒各分离株的5′UTR的序列表现一定程度的变异,AH-F10株与参考株的核苷酸序列同源性在94%~97%之间。此研究结果为进一步了解鸭坦布苏病毒的遗传变异及构建该病毒的反向遗传学操作系统奠定了基础。