牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株与野毒株PCR鉴别诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）ＴＫ基因和ｇＢ基因序列,应用Ｏｌｉｇｏ４．１程序设计两对引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２及ＰＢ１和ＰＢ２,分别对已构建的ＴＫ基因缺失（ＴＫ－）ＩＢＲＶ以及ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南１和云南２分离株进行了ＰＣＲ扩增。结果显示７株ＩＢＲＶＤＮＡ用引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２扩增均产生４５７ｂｐ的特异性片段,而ＴＫ－ＩＢＲＶ只出现１１０ｂｐ片段;用引物ＰＢ１和ＰＢ２对７株ＩＢＲＶＤＮＡ及ＴＫ－ＩＢＲＶＤＮＡ进行扩增均产生３３９ｂｐ的特异性片段;用此引物对其同属的伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）进行扩增,均未见特异性条带,从而证明该引物是特异的;ＰＣＲ的敏感性检测表明,该法可检测出３ｐｇ的病毒ＤＮＡ。所建立的方法可以鉴别野毒与ＴＫ－ＩＢＲＶ疫苗毒的感染。     

鸡传染性支气管炎北京地方株S_1基因的克隆与鉴定

利用反转录套式聚合酶链反应（ＲＴｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）技术从北京地区３株鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株（ＢＪ１,ＢＪ２,ＢＪ３）中扩增出１０５４ｂｐＳ１基因高变区。利用限制性内切酶ＳｉｎⅠ和ＰｓｔⅠ的酶切位点分析图谱进一步证实了ＲＴｎｅｓｔｅｄＰＣＲ的特异性。将３段Ｓ１基因分别克隆到ｐＵＣ１９质粒中,获得重组质粒ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ１,ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ２和ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ３。     

鸡传染性喉气管炎病毒中国王岗株糖蛋白gB基因克隆及鉴定

以ＰＵＣ１９质粒为载体构建了鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＥｃｏＲＩＤＮＡ文库。根据已经发表的澳大利亚ＩＬＴＶ－ＳＡ２株和英国ＩＬＴＶ－Ｖ８２２株的糖蛋白ｇＢ基因的核苷酸序列，设计并合成了一对引物，以ＩＬＴＶ中国王岗株ＤＮＡ为模板，扩增出１．３３８ｋｂ的糖蛋白ｇＢ基因片段，用ＤＩＧ标记制备成核酸探针，从ＩＬＴＶＥｃｏＲＩＤＮＡ文库中筛选出阳性重组子，得到一个ＥｃｏＲＩ３．０ｋｂ的ＩＬＴＶＤＮＡ片段。经酶切分析表明，该３．０ｋｂＩＬＴＶＤＮＡＥｃｏＲＩ片段含有完整的糖蛋白ｇＢ基因，经ＰＣＲ和核酸杂交表明所克隆的糖蛋白ｇＢ基因是特异的。     

分泌抗禽呼肠孤病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

采用腹腔接种和１次脾内注射禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）蛋白免疫小鼠，经３次融合后，共筛选出８株分泌抗禽呼肠孤病毒（单克隆抗体杂交瘤细胞株。这８株ＭｃＡｂ均可与ＡＲＶＳ１１３３株、ＦＤＯ株发生反应，而与ＩＢＤＶ，ＭＤＶ，ＥＤＳ－７６病毒不发生反应。经亚类鉴定，ＡＥ７，ＡＦ８，ＢＤ１，ＤＨ１０，ＥＥ５为ＩｇＧ１；ＡＤ６，ＣＧ４为ＩｇＧ２ａ；ＡＧ７为ＩｇＧ２ｂ。腹水效价在１０￣３～１０￣５之间。     

反转录－聚合酶链反应检测牛食道－咽部分泌物中的口蹄疫病毒

应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测牛食道－咽部分泌物（Ｏ－Ｐ液）中的口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）。第１组６份Ｏ－Ｐ液，采自人工感染发病牛，ＰＣＲ检测结果都是阳性；查毒试验结果５／６阳性。其中１份样品的１０－１，１０－２，１０－３和１０－３．７稀释液的ＰＣＲ检测结果也都是阳性；同样稀释的样品接种细胞，每稀释度２瓶，１０－１～１０－３都是２／２出现ＦＭＤＶ所致的细胞病变（ＣＰＥ），１０－３．７１／２出现ＣＰＥ。第２组样品是从野外采集的水牛Ｏ－Ｐ液，共５２份。ＰＣＲ检测结果９份为阳性，另７份为可疑（弱阳性）；取接种了这７份Ｏ－Ｐ液的细胞培养液（无ＣＰＥ）再作ＰＣＲ检测，结果全部是阳性。５２份Ｏ－Ｐ液样品分别接种ＩＢ－ＲＳ－２细胞培养物，并盲传３代，均未观察到典型的ＣＰＥ。研究结果表明，建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法不仅可用于检测细胞培养物和动物组织，也适用于检测牛Ｏ－Ｐ液中的ＦＭＤＶ。该方法比目前常规的查毒试验显著的快速和灵敏     

用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲型标准毒株（ＡＴＣＣＶＲ－２３３２）的ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７的序列,设计合成了一对引物２６３７４ＰＳ／２６３７５ＰＲ,用反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术对６株ＰＲＲＳＶ北京分离株进行了检测。结果该引物对６株病毒均能扩增出与预期大小相符的ＲＴＰＣＲ产物,并与ＡＴＣＣＶＲ２３３２株扩增产物的大小相当,而欧洲型标准毒株（ＬＶ株）未获扩增片段。进一步用限制性内切酶进行酶切分析,发现这６株病毒及ＡＴＣＣＶＲ－２３３２的ＰＣＲ产物皆出现相同的限制性酶切图谱,证实６株病毒均为ＰＲＲＳＶ。     

鸡传染性贫血病毒的分离鉴定

在山东省从死亡率达７２％、混合感染多种病原微生物的海兰白蛋鸡和艾维茵肉鸡群中分离到３株鸡贫血病毒（ＣＡＶ），这些毒株耐体积分数５０％氯仿和７０℃水浴１５ｍｉｎ，能在ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞内增殖。用分离的细胞毒接种１日龄ＳＰＦ鸡呈现典型的鸡传染性贫血特征性的临床症状和病理变化；用间接免疫荧光检查感染的ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞涂片和鸡组织触片，可见特异的核内荧光。分离毒株能被ＣＡＶ－ＴＫ５８０３株抗血清所中和；５周龄ＳＰＦ鸡接种分离细胞毒可产生ＣＡＶ抗体；电子显微镜观察，分离毒株ＭＳＢ１细胞培养物中有大量２０ｎｍ左右的病毒粒子。应用特异性ＰＣＲ引物可扩增到预计长度的病毒核酸片段，进一步证实分离株为ＣＡＶ。     

抗鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体中和株的建立

将纯化的鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）组织毒免疫的ＢＡＬＢ／ｃ鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，用ＥＬＩＳＡ、病毒中和试验检测分泌抗体，获得了６株稳定分泌抗ＩＢＤＶ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞，命名为ＮＩＢ－１，ＮＩＢ－２，ＮＩＢ－３，ＮＩＢ－４，ＮＩＢ－５，ＮＩＢ－６；６株ＭｃＡｂ均具ＥＬＩＳＡ特性和免疫沉淀特性，亚类鉴定表明，前４株属于ＩｇＧ_（２ａ），后２株属于ＩｇＧ_１。杂交瘤细胞冻存６个月后复苏，均能稳定分泌特异性ＭｃＡｂ。     

应用反转录 - 聚合酶链技术快速检测猪瘟病毒RNA的研究

依据猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）５′端非编码区保守序列设计一对ＰＣＲ引物，建立了检测ＣＳＦＶ的反转录聚合酶链（ＲＴＰＣＲ）技术。应用该技术从猪瘟兔化弱毒感染兔的脾、淋巴结、肾与肌肉等以及石门株强毒感染猪的脾与肌肉和湖北分离毒株感染猪组织匀浆液中均特异扩增出了１条预期大小为１９４ｂｐ的片段，从实验感染兔和猪的血液中也特异扩增出了该片段，但对牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）和健康兔脾总ＲＮＡ以及健康猪的血液ＲＮＡ扩增均为阴性。采用这种方法，对实验感染兔脾总ＲＮＡ的检测灵敏度可达１０－８ｇ，表明其灵敏度足以达到临床检验的要求。     

网状内皮组织增殖病病毒感染鸡红细胞免疫功能的动态变化

对１日龄ＳＰＦ鸡分别腹腔接种３株禽网状内皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ）的ＲＥＶ－Ｔ，ＤＩＡ和Ｃ４８株，测得试验鸡红细胞补体（Ｃ３ｂ）受体花环率自接种后１１ｄ起显著低于对照组；而红细胞免疫复合物（ＩＣ）花环率从接种后２５ｄ起（３２ｄ除外），又显著高于对照组。接种不同ＲＥＶ毒株的鸡红细胞Ｃ３ｂ受体花环率和ＩＣ花环率的变化程度不一致，表明不同毒株引起的免疫抑制程度不同。     

应用聚合酶链反应鉴别诊断马立克氏病病毒及免疫效果监测

应用３对引物建立了３套聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测体系。用该技术分别检测马立克氏病病毒（ＭＤＶ）１型、３型毒株，并能鉴别１型致癌性强毒株和非致癌性弱毒株；可从强毒感染发病鸡病变脏器和弱毒免疫的ＳＰＦ雏鸡不同时期采集的羽髓中检测到ＭＤＶ１型病毒的ＤＮＡ；可鉴别强毒发病鸡羽髓和弱毒免疫鸡羽髓。以羽髓为检测材料，应用上述ＰＣＲ技术可对ＭＤＶ１型弱毒疫苗免疫鸡群进行免疫效果监测。     

鸡腺胃型传染性支气管炎的诊断及病毒分离鉴定

天津市部分鸡场发生一种以病鸡极度消瘦、拉稀和死亡为主要特征的传染病，经鉴定确诊为鸡腺胃型传染性支气管炎（ ＧＩＢ） ，并分离出ＩＢＶ ＪＢ９７０２ 株，ＨＡ 效价为２１２，ＥＩＤ５０ 为１０ －６．８１／０ ．２ ｍ Ｌ。病毒干扰试验中，ＩＢＶＪＢ９７０２ ＋ ＮＤＶ ＬａＳｏｔａ接种鸡胚ＨＡ 效价为２４～６ ，ＬａＳｏｔａ 接种鸡胚ＨＡ 效价为２１０～１１ ；用ＩＢＶ ＪＢ９７０２ 病毒液１∶１０ 稀释后感染经ＩＢＶ Ｈ１２０ 弱毒疫苗免疫雏鸡，发病８／１０ ，死亡３／１０ 。     

用聚合酶链反应及核酸探针从新城疫病鸡体内检出传染性法氏囊病病毒

用鸡传染性法氏党病病毒（ＩＢＤＶ）逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和地高辛（ＤＩＧ）标记的ｃＤＮＡ探针组织印迹杂交试验，从某鸡场爆发新城疫（ＮＤ）的病鸡脾及法氏囊组织中检测到了ＩＢＤＶ，证明该ＮＤ病鸡存在ＩＢＤＶ的亚临床鸡鸡感染。进而分析了该疫情的爆发原因，并对鸡传染性法氏囊病的亚临床型感染和免疫程序进行了研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒北京分离株的ORF7克隆与序列分析

将北京地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ） 分离株ＢＪ２ 和ＢＪ４ 的ＯＲＦ ７ 及部分３’端非编码区（ ＵＴＲ） 的ＲＴＰＣＲ 扩增产物克隆连接于ｐ ＧＥＭＴｅａｓｙ 质粒载体上,重组质粒经ＥｃｏＲ Ⅰ酶切鉴定后进行了双链测序。测定的基因序列与欧美标准毒株已知序列比较发现,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与美洲ＶＲ２３３２ 株非常接近,在其长度为５５５ ｂｐ 的ｃＤＮＡ 序列中,仅与ＶＲ２３３２ 株分别相差１ 和２ 个核苷酸,其中ＯＲＦ ７ 的核苷酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别高达１００ ％ 和９９ ．４６ ％ ,其推导的氨基酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别为１００ ％ 和９９ ．２５ ％ ,３’ＵＴＲ 则完全相同;而与欧洲ＬＶ 株则有明显差异,其核苷酸序列同源性仅为６８ ．００ ％ 和６７ ．００ ％ ,推测的氨基酸序列同源性仅有６５ ．００ ％ 和６４ ．００ ％ ,且ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与ＬＶ 株相比缺失了ＫＫＳＴＡＰＭ 和ＡＳＱＧ 两段氨基酸序列,而３’ＵＴＲ 则比ＬＶ 株多出３８ ｎｔ 的一段特征性核苷酸序列。序列分析结果表明,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株属于同一基因型,且具有ＶＲ２３３２ 株的基因特点     

麻雀体内传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及理化特性研究

从传染性法氏囊病（ＩＢＤ）阳性麻雀体内分离到了一株病毒，用传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）单克隆抗体夹心ＥＬＩＳＡ试验和ＤＩＧ－标记ＩＢＤＶｃＤＮＡ探针斑点杂交试验证明该病毒为ＩＢＤＶ。病毒可适应于鸡胚和鸡胚成纤维细胞，产生细胞病变效应（ＣＰＥ）。病毒血清型鉴定为Ⅰ型，病毒代谢抑制试验证明其基因组为ＲＮＡ，病毒核酸的电泳图谱呈两条特征带。病毒对乙醚不敏感，ｐＨ２．０不能灭活病毒，ｐＨ１２可使病毒失去感染性，５６℃作用３小时病毒仍有活性，７０℃１小时可灭活病毒。以上结果表明从麻雀体内分离到的ＩＢＤＶ理化性质比较稳定，与目前鸡场流行的ＩＢＤＶ极为相似，可能与鸡ＩＢＤＶ同源，提示麻雀可能在ＩＢＤ流行病学中起主要作用。     

贵州省传染性法氏囊病病毒野毒株核酸及结构蛋白比较研究

采用氯仿抽提、聚乙二醇沉淀，再经差速离心和蔗糖密度梯度离心，从病变法氏囊组织中提取出较纯的传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）。病毒核酸电泳分析表明，４株ＩＢＤＶ分离株均由双节段ＲＮＡ组成，大小基因片段的电泳迁移率毒株间无差异。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析表明，ＩＢＤＶ分离株均由４条主要的结构蛋白带组成。近年从免疫鸡群中分离的地方强毒ＪＨ株及引自中监所的血清Ⅰ型强毒Ｊ＿１Ｃ＿７株，其主要结构蛋白带与早年分离的ＩＢＤＶ野毒株相似，电泳迁移率也基本一致。同时观察到毒株间各蛋白带相对百分含量的变化。     

斑点免疫金银染色法检测鸡传染性支气管炎病毒抗原的研究

用建立的斑点免疫金银染色（ＤｏｔＩＧＳＳ）法检测鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）抗原,确定兔抗ＩＢＶ血清工作浓度为１∶４００,ＳＰＡ胶体金探针的工作浓度为１∶８０,该法对纯化ＩＢＶ抗原的最低检出量为０．４３１４ｎｇ／点。用ＤｏｔＩＧＳＳ与斑点酶联免疫吸附试验（ＤｏｔＥＬＩＳＡ）同时检测１５只人工感染ＩＢＶ鸡的气管、肺、肾病料,ＩＢＶ阳性检出率均为１００％;对３２份疑似ＩＢＶ感染鸡病料检测,ＩＢＶ阳性检出率分别为３４．５％和３１．０％,阳性符合率为９３．３％（Ｐ＞０．０５）。     

分泌抗鸡病毒性关节炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用鸡病毒性关节炎病毒（ＲｅｏＶ）免疫８ＡＬＢ／Ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ＿２／Ｏ细胞在聚乙二醇作用下融合，用ＥＬＩＳＡ法检测和筛选，以有限稀译法克隆３次，获得４株分泌抗ＲｅｏＶ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞，在传代期间能稳定地分泌ＭｃＡｂ。用杂交瘤细胞注射ＥＡＬＢ／Ｃ小鼠诱生腹水，其ＥＬＩＳＡ抗体效阶达４０００～８０００，在－７０℃条件下保存半年，其抗体效价不变。特异性分析结果表明，该ＭｃＡｂ只特异地与ＲｅｏＶ发生反应，而不与ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＢＤＶ发生反应。     

鸡传染性法氏囊病ELISA快速诊断盒的研制及应用

用ＩＢＤ－ＥＬＩＳＡ快速诊断盒对ＩＢＤＶ阳性法氏囊囊毒及ＩＢＤ阳性血清，ＩＢＤＶ阴性法氏囊及ＩＢＤ阴性血清和ＩＢ，ＩＬＴ，ＥＳＤ－７６，ＲＥＯ，ＮＤ，ＭＤ等６种鸡传染病的抗原及阳性血清检测，只有ＩＢＤＶ阳性法氏囊囊毒及阳性血清呈阳性反应，证明快速诊断盒对ＩＢＤＶ法氏囊囊毒抗原及其抗体的检测是特异的，与其它６种传染病的抗原和抗体无交叉反应。与ＡＧＰ对比试验结果表明，检测ＩＢＤＶ阳性法氏囊囊毒时，快速诊断盒的敏感性比ＡＧＰ的敏感性高３２倍；检测ＩＢＤ阳性血清及蛋黄抗体液时，前者的敏感性比后者高２～１０倍。快速诊断盒的保存期可达２４个月以上。通过在１２个省（市、区）有关单位试用，证明ＩＢＤ－ＥＬＩＳＡ快速诊断盒具有快速、简便、特异、灵敏等优点     

鸡减蛋综合征病毒内蒙古株的培养和动物回归试验

鸡减蛋综合征（ＥＤＳ）病毒内蒙古分离株（Ｎ３和Ｂ４株）由本院家畜传染病教研组分离、保存。为进一步了解Ｎ３和Ｂ４株的生物学特性,我们对分离株进行了培养和致病性试验。１材料和方法１．１材料１．１．１ＥＤＳ病毒参考毒株ＥＤＳ病毒ＡＶ１２７株和ＮＥ４株,分...