猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建及其免疫效果

构建了泛素(ubiquitin,Ub)基因与密码子优化的PRRSV GP5蛋白(optiGP5)基因融合表达质粒pIR-Ub-optiGP5。间接免疫荧光和Western-blot分析表明,重组质粒转染293T细胞后能够瞬时表达。将pIR-optiGP5和pIR-Ub-optiGP5两种质粒DNA肌肉注射免疫BALB/c小鼠后,分别检测小鼠血清中抗GP5抗体、T淋巴细胞的增殖能力以及CTL活性。结果显示,pIR-optiGP5质粒免疫组在二免后可以检测到荧光抗体,而pIR-Ub-optiGP5质粒免疫组一直未检测到抗GP5抗体,但该免疫组的T淋巴细胞增殖指数及针对GP5的特异性CTL反应数值明显高于pIR-optiGP5质粒免疫组。这表明泛素与GP5的融合表达可增强细胞免疫反应。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原表位基因的表达及其表达产物的抗原性

为了确定猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白A、B抗原表位之间的相互关系和对免疫的影响,应用PCR方法扩增出A、B抗原表位基因并分别克隆于原核和真核表达载体中。原核重组质粒表达的重组蛋白经Western-blotting检测证明,该重组蛋白具有良好的抗原性。将重组蛋白和真核表达质粒免疫小鼠,前者可诱导产生针对PRRSV的特异性ELISA抗体,但是此抗体没有中和活性;后者不能诱导免疫小鼠产生PRRSV特异性抗体。结果表明,中和抗体的产生不但与A、B表位的空间构象有很大的关系,如果蛋白质分子质量过小也不能诱导机体产生有效的免疫反应。     

PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原优势区基因真核表达质粒的构建及其免疫效果

采用PCR法扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2抗原优势区(ORF2′)基因和猪细小病毒(PPV)VP2基因,将目的基因定向插入真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2′-VP2。将重组质粒免疫小鼠,同时设立PCV亚单位疫苗、PPV灭活疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,PCV2和PPVIgG抗体效价进行了检测。结果表明,从免疫后第7d起,pCI-ORF2′-VP2免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和抗PCV2、PPV的特异性抗体效价都显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于空载体对照组,且重组质粒组在第21～42d诱导的免疫水平显著或极显著强于PPV灭活疫苗组。证实,构建的重组质粒pCI-ORF2′-VP2能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

猪瘟病毒囊膜蛋白基因pcDNA4.0-E重组质粒的构建及其对小鼠的免疫原性

以猪瘟病毒石门株RNA序列为模板,应用RT-PCR方法,克隆得到猪瘟病毒囊膜蛋白E0-E2cDNA全序列,并将其与真核表达质粒pcDNA4.0定向连接,构建了重组质粒pcDNA4.0-E。经提纯后,给试验组小鼠后肢胫前肌注射pcDNA4.0-E,每只100μg,15 d后再注射1次,同时设空白对照组。于二免后第10、203、0 d分别扑杀小鼠,进行免疫小鼠脾和外周血淋巴细胞的转化增殖试验,并用间接ELISA法检测血清抗体水平。结果显示,与空白对照组相比,所构建的重组质粒能够极显著增强小鼠脾细胞和外周血淋巴细胞的增殖(P<0.01),血清抗体水平从二免后的第10 d开始逐渐升高,且极显著高于对照组(P<0.01)。说明该重组质粒能够诱导小鼠产生特异性免疫反应。     

缺失信号肽和跨膜区的PRRSV GP5融合蛋白基因的表达

通过分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HH08株GP5基因序列,设计了2对引物,经PCR扩增,获得不含信号肽和跨膜功能区的GP5基因片段,长度分别为121 bp和248 bp。应用酶切位点相连构建融合基因技术,将2段基因亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组表达质粒pET-GP5。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得高效表达。免疫印迹试验证实,表达的融合蛋白能与特异性血清抗体反应,表明表达的PRRSV GP5蛋白具有良好的生物学活性。     

猪囊虫TS21抗原DNA接种小鼠的免疫应答

将 4 0只BALB/c小鼠随机分为 2组 ,A组以VR10 2 0免疫作为对照 ,B组以TS2 1抗原基因的真核表达型质粒VTS2 1免疫。用ELISA检测免疫小鼠IgG总量和特异性抗体水平 ,MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞伴刀豆蛋白A(ConA)刺激的增殖反应及IL 2的诱生活性 ,常规法检测外周血免疫细胞数量的动态变化。结果显示 ,VTS2 1免疫小鼠血清的IgG含量和特异性抗体效价显著高于对照组小鼠 ;免疫小鼠脾淋巴细胞ConA刺激增殖反应和IL 2诱生活性均比对照组小鼠显著增强 ;免疫小鼠的淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞的数量也显著超过对照组。免疫小鼠的细胞和体液免疫反应显著增强 ,表明VTS2 1具有很强的免疫激活作用 ,有进一步研制开发成为猪囊虫病DNA疫苗的潜力     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

牛分枝杆菌esat-6和mpb70-mpb83基因DNA疫苗的免疫效果

用PCR技术和重叠延伸剪接技术获得牛分枝杆菌esat-6基因和mpb70-mpb83融合基因,连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pCE6和pC70-83-E6。分4组免疫小鼠:pCE6组、pC70-83-E6组、pcDNA3.1(+)和PBS对照组,采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况。结果表明,2重组质粒免疫组小鼠的血清抗体水平持续上升,而2对照组始终维持在较低水平,且pC70-83-E6组小鼠的抗体水平高于pCE6组。经PPD刺激后,pCE6组和pC70-83-E6组小鼠的SI值与2对照组均差异显著(P<0.05),2重组质粒免疫组间差异不显著(P>0.05);2重组质粒免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ均显著高于2对照组(P<0.05),且pC70-83-E6组明显高于其他3组(P<0.05)。证实本试验构建的2种牛分枝杆菌DNA疫苗可有效诱导实验动物产生体液免疫和细胞免疫应答。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位区与猪细小病毒VP2真核表达质粒的构建及免疫效果

筛选了3个位于流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白上不同位置的抗原表位区基因,利用重叠PCR方法分别与猪细小病毒(PPV)VP2基因相连。将目的基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pcDNA3.1-EA-VP2、pcDNA3.1-EB-VP2、pcDNA3.1-EC-VP2。将重组质粒在无免疫佐剂参与的情况下免疫BALB/c小鼠,同时设空质粒接种组及PBS缓冲液接种组作为空白对照,采用ELISA法、淋巴细胞增殖试验和流式细胞仪技术分别对抗体水平、脾淋巴细胞转化功能和小鼠外周血中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞数进行检测。结果显示,重组质粒pcDNA3.1-EA-VP2、pcDNA3.1-EB-VP2、pcDNA3.1-EC-VP2接种小鼠后,都能诱导小鼠产生JEV、PPV特异性抗体,并且促进脾淋巴细胞增殖。试验组与对照组比较差异极显著(P0.01);试验组小鼠CD3+、CD4+T淋巴细胞数在首疫后第7天高于对照组(P0.01),CD8+T淋巴细胞数在首免后第14天高于对照组(P0.01)。pcDNA3.1-EB-VP2免疫组小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平均高于pcDNA3.1-EA-VP2和pcDNA3.1-EC-VP2免疫组。表明,用JEV E蛋白抗原表位区基因与PPV VP2基因构建的真核表达质粒能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

微小隐孢子虫P23基因真核表达质粒在HeLa细胞中的表达及其免疫小鼠血清抗体效价的检测

为观察微小隐孢子虫P23基因真核重组质粒在He La细胞中的表达及免疫小鼠血清抗体产生情况,通过设计特异性引物,利用PCR技术,对微小隐孢子虫卵囊基因组DNA进行P23基因扩增;将扩增产物插入真核表达载体p VAX-1中,构建重组真核表达质粒p VAX1-P23,转染He La细胞,运用间接免疫荧光法及Western-blot技术,验证重组质粒在He La细胞中的表达情况;将重组质粒p VAX1-P23免疫小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清特异性抗体产生情况。结果显示,成功地扩增了长度约为336 bp的微小隐孢子虫P23基因;双酶切和序列测定结果显示,构建的真核重组表达质粒p VAX1-P23中外源基因序列和插入位置正确;间接免疫荧光法及Western-blot分析显示,p VAX1-P23真核重组表达质粒在He La细胞中被成功表达;小鼠免疫重组质粒2周后,即可检测到抗体产生,直至第8周试验结束。结果表明成功地构建了真核重组表达质粒p VAX1-P23,该重组质粒能在He La细胞和小鼠体内表达,并诱导小鼠产生显著的体液免疫反应,为进一步开展隐孢子虫P23蛋白特性研究、研制抗隐孢子虫病核酸疫苗奠定了基础。     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建

采用RT PCR技术从长白猪的肌肉组织中扩增出了泛素 (Ubiquitin)基因 ,并将其克隆到 pGEM Teasy载体 ,经测序表明 ,所克隆的基因与GenBank中已登录的序列同源性达 99%。利用设计的融合表达引物 ,分别将泛素基因与猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV )GP5蛋白成熟肽基因进行扩增 ,用重叠区扩增基因拼接法将 2个基因片段进行拼接 ,并插入真核表达载体 pcDNA4 .0HISMAXA中 ,构建出了 pcDNA U GP5重组质粒。     

猪传染性胃肠炎病毒S-N融合双基因疫苗的构建及其免疫原性分析

为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基因的重组质粒pVAX-S-N,将pVAX-S-N转染COS7细胞以免疫荧光试验进行S、N双基因的表达鉴定。用纯化的pVAX-S-N和作为对照的pVAX-S、pVAX1、PBS免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,分别测定免疫后第0、14、28、42天的小鼠血清IgG抗体,测定免疫后第42天小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的数量。结果,融合质粒pVAX-S-N可在COS7细胞特异性表达S、N两个蛋白,pVAX-S-N免疫小鼠后第14天即可诱导产生抗TGEV的特异性IgG,但pVAX-S-N诱导的抗体水平一直低于pVAX-S诱导的抗体水平,在免疫后第42天差异极显著(P<0.01);pVAX-S-N可激发小鼠产生细胞免疫应答,但pVAX-S-N组的CD3+、CD4+、CD8+数量均低于pVAX-S免疫组。研究结果表明,融合双基因疫苗pVAX-S-N具有免疫原性,但免疫效果却不如单基因疫苗pVAX-S的理想。     

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86 mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康大白仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)共刺激分子CD80-CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明,在感染后第3 d和第7 d CD80与CD86 mRNA转录显著下调(P<0.05),感染后第14 d CD86 mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80 mRNA转录水平在第14 d和第28 d高于对照组,CD86 mRNA转录水平在第28 d高于对照组,两者在第42 d均高于对照组,但无显著差异。证实,PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PAM的抗原呈递能力受到影响。     

鸡IL-2和IL-15基因真核表达质粒对禽流感疫苗的免疫增强作用

根据GenBank中的鸡IL-2和IL-15序列设计了2对引物,采用RT-PCR法从山地乌骨鸡外周血淋巴细胞RNA中克隆了IL-2和IL-15基因,与pcDNA3.1连接构建了真核表达质粒pDNAIL-2和pDNAIL-15,研究了其对禽流感灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示,免疫后第10d,pDNAIL-15 AI灭活疫苗组和pDNAIL-2 AI灭活疫苗组HI抗体水平显著高于AI灭活疫苗组(P<0.05)。免疫后第10 d,pDNAIL-15 AI灭活疫苗组CD4 淋巴细胞百分含量显著高于pDNAIL-2 AI灭活疫苗和AI灭活疫苗组(P<0.05);免疫后第23 d,pDNAIL-2 AI灭活疫苗组CD4 淋巴细胞百分率显著高于pDNAIL-15 AI灭活疫苗和AI灭活疫苗组(P<0.05)。证实pDNAIL-2和pDNAIL-15能提高禽流感灭活疫苗的免疫效果。     

猪生殖与呼吸综合征ORF5基因疫苗的构建及其安全性和免疫原性检测

克隆了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SC2株ORF5基因。测序分析表明SC2株属美洲型PRRSV。构建的ORF5基因疫苗经脂质体转染Marc 145细胞后,第26h检测到疫苗蛋白的特异性表达,第56h达到高峰。疫苗肌肉注射小鼠和仔猪后能迅速分布到各组织器官中,未发现核酸疫苗与宿主细胞染色体整合现象;且能使仔猪产生体液和细胞免疫应答,免疫期持续135d以上。结果表明,构建的PRRSVORF5基因疫苗具有良好的安全性和免疫原性。     

巴马香猪超前免疫高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的免疫效果评价

为了评价高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗(JXA1-R)对仔猪超前免疫的免疫效果及安全性,给3头巴马香猪超前免疫弱毒疫苗JXA1-R 1头份/头,以3头同窝仔猪为对照组,接种等量疫苗稀释液,观察疫苗免疫后的临床表现,测定疫苗免疫后的抗体动态变化及排毒情况;免疫后第35天,采用高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1)攻毒,测定攻毒后的抗体变化、排毒情况及免疫保护作用。结果表明,巴马香猪超前免疫后第14天发生抗体阳转,鼻拭子样品、肛门拭子样品和血清样品中均检测到病毒核酸,同居的阴性对照组中有1头仔猪发生抗体阳转,提示该疫苗存在排毒现象。攻毒前免疫组和对照组的抗体阳性率分别为3/3和1/3;攻毒后免疫组和对照组的免疫保护率分别为3/3和1/3,表明该疫苗具有一定的免疫保护作用,但初生巴马香猪超前免疫后表现生长缓慢,被毛粗乱,提示该疫苗对仔猪具有一定的毒力,不适合用作超前免疫。     

弓形虫代谢分泌抗原对猪T细胞亚群的影响

为了研究弓形虫代谢分泌抗原对仔猪T细胞亚群及抗体的影响,将仔猪随机分为6组,每组5只,分别为E/SA组、E/SA+CPG(未乳化)组、E/SA+CPG组、E/SA+IL-2组、E/SA+IL-2+CPG组及对照组.分别于免疫前、免疫后第2周、免疫后第4周、感染后第1周及感染后第2周采集仔猪外周血,用流式细胞仪对各试验组外周血中CD4+及CD8+T淋巴细胞亚群的动态变化规律进行检测,用IHA对抗弓形虫抗体水平做检测.结果显示,弓形虫代谢分泌抗原免疫仔猪后第4周,免疫组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞水平和特异性抗体效价与对照组相比均有大幅度升高;感染后第1周,免疫组CD4+T细胞水平及CD4+/CD8+比值较感染前有不同程度降低,感染后第2周,免疫组CD4+T细胞水平及CD4+/CD8+比值上升至免疫后水平,CD8+水平下降,感染后特异性抗体效价进一步升高.表明,弓形虫代谢分泌抗原能够提高仔猪外周血CD4+及CD8+T淋巴细胞水平和特异性抗体水平.