钩藤碱在Caco-2细胞模型中吸收规律研究

目的 建立体外模拟体内肠道细胞——人结肠癌上皮细胞（the human colon adenocarcinoma cell line，Caco-2）的Transwell模型，以此研究钩藤碱在Caco-2细胞模型上的跨膜转运特征。方法 采用聚酯碳酸酯膜连续培养Caco-2细胞21 d，形成致密的单层细胞模型。然后对影响钩藤碱在Caco-2细胞模型上转运特征的因素(包括浓度、时间及跨膜转运蛋白P-糖蛋白)进行考察；同时采用液相色谱-质谱法对溶液中钩藤碱的含量进行测定。结果 钩藤碱在Millicell系统上的转运量具有一定的浓度-时间依赖性，主要以主动转运的方式进行吸收，且随着时间和药物浓度的增加，转运量明显增加。不同浓度钩藤碱从细胞基底侧（basolateral, BL）到细胞刷状缘侧（apical，AP）的表观渗透系数（apparent permeability coefficient, Papp）与AP侧到BL侧的Papp比值均在1.5以上，且钩藤碱从BL侧到AP侧的外排速率明显高于从AP侧到BL侧的吸收速率。当加入P-糖蛋白抑制剂后，药物由BL侧向AP侧的转运量显著减少，而由AP侧到BL侧的转运量显著增加。结论 钩藤碱在Caco-2细胞上转运存在一定的浓度及时间依赖性，且P-糖蛋白介导钩藤碱在Caco-2细胞上转运。     

鸡胚胎腺垂体糖蛋白激素α亚单位细胞的发育及其变化

应用免疫组织化学方法,对第3.5～20.5天鸡胚腺垂体糖蛋白激素α亚单位(PGHα)细胞的发生及其在发育过程中的变化规律进行了研究。结果,鸡胚发育的早期(第6.5天),可观察到少量明显的PGHα细胞分布于腺垂体前、后叶,随着胚胎的发育,PGHα细胞数量显著增加(P<0.05),分布于腺垂体前、后叶和结节部,且后叶PGHα细胞数多于前叶。早期PGHα细胞体积小、细胞浆少、细胞核大,随着胚龄的增加,细胞体积增大、细胞浆增多、细胞浆浓染。结果表明,鸡胚腺垂体PGHα细胞发生于胚胎发育的早期,细胞的增殖和分化过程发生在胚胎发育的中后期。     

急性心肌梗死时人心脏房室结细胞糖蛋白表达

目的观察急性心肌梗死时心传导系统糖蛋白表达。方法运用花生凝集素(PNA),对8例急性心肌梗死亡者的心传导系统标本进行亲和组化染色。结果PNA有7例呈现强阳性,1例出现弱阳性。结论房室结传导细胞在缺血时细胞膜表达PNA受体,提示急性心肌梗死时房室结细胞和工作心肌都不同程度受累,并且细胞病理改变机制可能相关或类似。     

体内咪达唑仑代谢研究

提取小鼠肝P450酶,建立咪达唑仑的体外代谢模型.确定了其在体内的主要代谢产物的结构;通过优化药物体外代谢的条件,获得了较高纯度的咪达唑仑代谢物(α-OH咪达唑仑)对照品.通过志愿者实验,考察了咪达唑仑在体内的代谢过程和咪达唑仑及其代谢物α-OH咪达唑仑在体内的消除过程.结果表明以代谢物α-0H咪达唑仑作为分析目标物,建立灵敏、快速的分析方法,可使体内咪达唑仑检测的检出时限从6h延长至48h.该研究结果可满足实际检案需要,并可为分析结果的评价提供依据.     

小反刍兽疫病毒H糖蛋白基因原核表达载体的构建及表达

参照GenBank中小反刍兽疫病毒(PPRV)H抗原基因序列,人工合成了PPRV H基因,将其克隆至pUC18-T质粒中,转化E.coliJM109感受态细胞,构建并选择PPRV H基因克隆重组质粒,经核苷酸序列分析正确,将其克隆至pBAD/Thio-TOPO载体中,转化E.coliTOP10感受态细胞,核苷酸序列分析证实,成功构建了PPRV H基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导,可稳定、高效地表达PPRV H抗原。SDS-PAGE分析结果表明,用终浓度为0.2 g/L的L-阿拉伯糖诱导5 h的表达量最高,表达蛋白为分子质量约83 ku的融合蛋白;经薄层扫描分析,其表达产量约占菌体总蛋白的10%。Western-blotting检测表明,诱导的蛋白能与PPRV H蛋白单抗发生特异性反应,说明表达的融合蛋白中含有PPRV H糖蛋白抗原。     

我国新城疫强毒株F糖蛋白基因的体外合成及其抗原性研究

将我国新城疫强毒株Ｆ４８Ｅ９在ＳＰＦ鸡胚增殖后提取ＲＮＡ，用自行设计的一对寡聚核苷酸引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，合成了Ｆ糖蛋白基因片段。将此片段与ｐＵＣ１９质粒重组，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，从阳性克隆中提取重组质粒，再用ＰＣＲ法扩增，获得了同样大小的ＤＮＡ片段。经用特异性抗体探针检测，证明该片段在大肠杆菌中的表达产物具有良好的抗原性     

化学佐剂对猪瘟病毒E_2基因疫苗免疫增强作用的研究

以昆明小白鼠为试验动物,研究了化学佐剂对猪瘟病毒E2 囊膜糖蛋白( HCV E2) 基因疫苗的免疫增强作用;用印度墨水活体染色法筛选促进印度墨水在肌肉中扩散的化学试剂,并用筛选到的化学试剂与pCDLacZ 混合肌肉注射小白鼠。结果表明,斯苯和甘油能较好的促进LacZ 基因在小白鼠胫前肌中表达,提示斯苯和甘油可作为基因疫苗的化学佐剂;用斯苯和甘油按比例混合配制HCV E2 基因疫苗质粒pCDST 免疫小白鼠,其抗体效价显著高于蔗糖、甘油、斯苯单一佐剂。     

猪瘟病毒石门株E2蛋白的单抗制备及抗原表位鉴定

用猪瘟病毒石门株E2(SM-E2)的BC区原核表达蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单抗,测定其效价并鉴定抗原表位。结果表明,制备了1株持续、稳定分泌抗SM-E2的单克隆抗体2B10,效价在1∶600～1∶1 000之间。单抗2B10能与常规SDS-PAGE转膜的SM-E2蛋白发生反应,表明其识别的是线性表位,并且该单抗只能识别石门毒株,而不能与C株疫苗及2型流行毒株发生反应。点突变E2蛋白ELISA分析结果表明,该单抗不与707、709、711、713和714位突变蛋白发生反应,表明单抗2B10识别的线性表位为707I-X-P-X-G-X-G-G714。该单抗对猪瘟病毒抗原多样性分析和致病机制研究有一定的应用价值。     

大黄酸对SLT-Ⅱe诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌细胞因子的影响

通过检测大黄酸对SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、前列环素(PGI2)、血栓素A2(TXA2)、P-选凝素及可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)的浓度变化,以探索中药复方主要成分大黄酸对仔猪水肿病的疗效机制。将培养的肠黏膜微血管内皮细胞分为对照组、SLT-Ⅱe组、不同浓度大黄酸处理组等5个组,采用ELISA法测定了培养3、6、9和12h时细胞培养上清液中NO、ET-1、PGI2、TXA2、P-选凝素及sICAM-1浓度的变化。结果显示,5μg/mL大黄酸可显著下调SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞NO、P-选凝素及sICAM-1的分泌,12h内使NO、P-选凝素及sICAM-1的分泌浓度接近正常水平,对ET-1的分泌也有一定的抑制作用;1、5、10μg/mL大黄酸不能下调SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞PGI2和TXA2的分泌。表明,大黄酸通过抑制SLT-Ⅱe诱导肠黏膜微血管内皮细胞NO、ET-1、P-选凝素及sICAM-1的过量分泌,缓解肠道微循环障碍,减轻炎症反应,达到治疗水肿病的目的。     

表达狂犬病病毒CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒在犬体内的免疫效果

为研制一种新型有效的狂犬病重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,将酶切鉴定为正向连接的阳性重组子命名为p8AA-EGFP-rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得能够表达狂犬病病毒(RV)CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV/EGFP-rgp,经RT-PCR和Western-blot鉴定后对犬进行肌肉注射免疫,并测定相应试验指标,研究重组病毒对犬的免疫诱导情况.结果显示,重组病毒可以有效地刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;产生的针对RV的中和抗体水平[(0.95±0.21)U/mL]在14周时还保持相对国际最低保护标准(0.5U/mL)较高的水平;且产生的针对RV和PRV的中和抗体水平均达到了相应灭活疫苗和减毒活疫苗的水平,抗体效价均维持在14周以上.