犬冠状病毒TN449株M基因的克隆与转移载体的构建

用蔗糖密度梯度离心纯化犬冠状病毒TN449株病毒液,提取总RNA并反转录,同时设计1对5′端加有BamHⅠ和HindⅢ内切酶位点的引物,对病毒cDNA进行了PCR扩增,回收PCR产物将其连接入pGEM-TEasy载体并转化大肠埃希氏菌。并对阳性重组质粒菌测序和序列分析。结果,犬冠状病毒与牛冠状病毒、猫冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、人冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鼠传染性肝炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、人重症急性呼吸道综合征病毒和猪胃肠炎病毒的同源性分别是39.39%、85.41%、83.98%、36.80%、26.64%、37.23%、93.51%、29.00%和94.81%;犬冠状病毒M蛋白有3个疏水性结构域。同时构建了pET28a-CCV-M表达质粒。     

微小牛蜱Bm86基因的克隆及真核表达载体的构建

为了克隆微小牛蜱Bm86 基因及构建该基因的表达载体,以微小牛蜱饥饿幼蜱的破解物提取的总RNA为模板,参照已发表的微小牛蜱Bm86基因的核苷酸序列,设计了1对引物,采用RT-PCR技术获得微小牛蜱Bm86基因;将Bm86基因克隆入载体,并进行序列分析,结果证明,克隆的Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因序列的同源性达97.4%,而且该序列包含完整的开放阅读框。将该基因克隆入真核表达载体 pPIC9K,构建并获得了重组真核表达载体pPIC9K-Bm86。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

新城疫病毒广西分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)F基因序列设计了2 对引物,对从广西分离的10株NDV毒株的F基因进行了分段扩增和序列测定,其基因序列全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,均有6个潜在的糖基化位点。将其F基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表的10株NDV 参考株的F 基因序列进行了比较。结果表明,核苷酸序列的同源性为82.6% ~98.1%,氨基酸的同源性为87.7%~98.7%。这10株NDV广西分离株在裂解位点的氨基酸序列(112R R Q K/R R F117)与NDV强毒株特征相符合。系统发育树、酶切位点分析和基因分型结果表明,10 株NDV广西分离株中GX1/00、GX2/00、GX4/00、GX6/02、GX7/02、GX9/03、GX10/03和GX11/03为基因Ⅶd亚型,GX3/00和GX5/00为基因Ⅲ型。     

禽劳斯肉瘤病毒群特异性抗原基因gp27片段的克隆及序列测定

以RT PCR方法从人工感染禽劳斯肉瘤病毒 (Roussarcomavirus ,RSV )SR RSV的SPF雏鸡体内及SPF鸡胚成纤维细胞 (CEF)培养物中分别扩增出 72 0bp的 gp2 7片段 ,将RT PCR产物重组到质粒载体 pUC19中 ,并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明 ,克隆片段为完整的目的基因 ,该片段的核苷酸序列与国外分离株RSVJ0 2 342的同源性达 97.3%。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清7型25-4株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜蛋白(OMP)基因特异片段,并克隆于pMD 18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1,成功构建了重组表达载体pGEX-omp;以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),经SDS-PAGE鉴定,表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku,命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解,获得切掉标签的OMP。经ELISA检测,该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应,具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APPOMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。     

“克隆人”带来的生育权问题

随着科学技术的不断发展,从自然生育到人工生育再到克隆人,生育经历了一个不断发展变化的过程.本文分析了各国关于克隆人的立法情况及克隆人的伦理道德问题,就克隆人的家庭问题以及克隆人受歧视等问题进行了初步探讨.     

广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡γ-干扰素的基因序列设计了1对特异性引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡外周血淋巴细胞RNA中扩增了γ-干扰素基因,结果。均得到了大小为520 bp的特异性片段。将扩增产物纯化并克隆到 pMD18-T载体上,获得重组质粒,经PCR和EcoR Ⅰ Sal Ⅰ双酶切鉴定后测序。序列分析结果表明,广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因均编码145个氨基酸的成熟蛋白,分子质量约为16．8 ku,与哺乳动物和其他品种鸡的核苷酸序列同源性分别为38．8％～39．0％和99．2％～100％,氨基酸序列同源性分剐为23．6％～24．8％和97．6％～99．4％。     

艾维茵商品肉用鸡白细胞介素-2基因的克隆及其二级结构分析

根据Sundick等发表的鸡白细胞介素 2 (IL 2 )基因序列设计一对特异性引物 ,从伴刀豆球蛋白A (ConA)体外激活的脾淋巴细胞中提取mRNA ,通过RT PCR方法获得艾维茵商品肉用鸡IL 2cDNA基因。将其连接到测序载体 pGEM TEasyVector ,测序后用Pcgene和DNAstar软件分析。结果显示 ,艾维茵商品肉用鸡IL 2基因长 734bp ,编码一由 14 3个氨基酸组成的前体蛋白 ,与来自GenBank的另外 3个品系 (Kestrelleghorn ,Obese和SC)鸡IL 2比较 ,其核苷酸和氨基酸序列同源性为 98.9%～ 10 0 %和 97.2 %～ 10 0 %。二级结构预测表明 ,艾维茵商品肉用鸡IL 2N端存在一条由 2 2个氨基酸组成的前导肽及 4个半胱氨酸形成的链内二硫键 ,并存在类似人IL 2的 4个α螺旋 ,这些结构很可能在维持IL 2生物学活性中发挥重要作用。基因系统进化树分析表明 ,艾维茵商品肉用鸡与SC鸡IL 2的亲缘关系较近 ,与火鸡、Kestrelleghorn和Obese鸡IL 2的亲缘关系较远。     

绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜基因的定向克隆与融合表达

根据绵羊肺腺瘤病毒(SJRV) NM株基因组全序列,设计了 1 对包含囊膜(env)基因在内的引物,并在5′端分别设计了HindⅢ和 BamHⅠ酶切位点,利用 PCR技术扩增 env基因,通过连接反应将其克隆于pET 30b表达载体上。序列分析表明,env基因全长 1 836 bp,编码 612 个氨基酸残基;构建表达重组质粒env pET 30b,转化大肠埃希氏菌 BL21,经 IPTG于 37 ℃诱导培养,SDS PAGE电泳分析表明,表达的env基因融合蛋白分子质量约为69 ku。