重组鸡IFN-α的高效表达与一步复性和纯化

通过在线网站以及生物学软件分析,将天然鸡IFN-α基因中的稀有密码子同义替换为大肠杆菌偏好的密码子.优化后的基因经人工合成后与温控型表达载体pWL连接并转入大肠杆菌中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达产物的分子质量约为19 ku,表达量占总蛋白的28.3%.表达产物主要以包涵体形式存在,用高浓度变性剂溶解后,采用Sephadex G50凝胶过滤一步复性并纯化重组鸡IFN-α,纯度可达98%以上.每1 L培养基可以得到47.1 mg的重组鸡IFN-α,产出率达34.14%.表达的重组鸡IFN-α在CEF/NDV检测系统上的比活性为1.12×10~8U/mg.     

猕猴肠侵袭型大肠杆菌的分离鉴定及其毒力因子基因的检测

2010年5月从四川省某猕猴养殖场急性腹泻猕猴肠道内分离出4株致病性大肠杆菌,并对其进行了16SrDNA扩增、生化反应、血清型鉴定、药敏试验以及毒力因子基因的分子生物学检测。结果显示,该菌株血清型为O28;药敏试验证实该菌对多种抗生素具有抗性,并且呈现多重耐药性;攻毒试验证实该菌能够导致小白鼠大量死亡;多重PCR成功检测出侵袭性大肠杆菌的Einv毒力基因。确定该病原菌为肠侵袭型大肠杆菌,而且毒力很强。     

猪戊型肝炎病毒swCH196株ORF3基因的克隆与序列分析

为分析猪戊型肝炎病毒的基因特征,设计了1对套式引物,利用RT-PCR方法克隆出了猪戊型肝炎病毒甘肃分离株swCH196的ORF3基因cDNA片段。序列测定结果表明,swCH196株的ORF3基因长345bp,编码114个氨基酸,与GenBank中登录的其他毒株的核苷酸序列同源性为83.5%～97.7%,系统发育进化树分析结果表明,该分离株为基因Ⅳ型。     

猪生殖与呼吸综合征病毒NM1株的分离鉴定及其Nsp2基因的序列分析

从内蒙古某猪场患高热症病猪病料中分离到1株病毒,该病毒能在Marc-145细胞上增殖,产生细胞病变.经RT-PCR法鉴定证明,该病毒为美洲型PRRSV,将其命名为NM1.应用设计的特异性引物扩增NM1株的Nsp2基因,并与国内外PRRSV分离株的Nsp2基因序列进行了比较.结果表明,NM1株Nsp2基因推导的氨基酸序列出现30个不连续的缺失,与PRRSV高致病性毒株HUN4、HuB2、JXA1的核苷酸序列同源性分别为99.1%、99.0%和98.9%.动物回归试验结果显示,人工感染的5头仔猪全部发病,其中3头死亡,说明NM1株为发生变异的PRRSV,其致病力有所增强.     

猪生殖与呼吸综合征病毒NX/ZhW/07株的分离鉴定及其ORF5、Nsp2基因特性分析

将2007年宁夏送检的疑似猪高热病病料处理后接种于Marc-145细胞,结果Marc-145细胞出现典型的细胞病变,应用猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,将其命名为NX/Zhw/07.采用RT-PCR方法扩增该分离株的ORF5和Nsp2基因,并进行序列分析.结果表明,NX/ZhW/07株的ORF5基因与GXHP-5、Hainan-1、HUBl、Hunan-1、JIANGSU、Jiangxi-1、LN-5和SHH-5株的核苷酸序列的同源性分别为92%～94%,其中与CH-la株的核苷酸序列的同源性最高,达99.2%.Nsp2基因序列分析显示,出现30个氨基酸的不连续缺失,与国内高热病分离株JXA1的缺失位置完全一致.由此推测NX/ZhW/07株属于PRRSV美洲型变异株.     

片形吸虫线粒体nad1基因的序列分析及种系发育

为阐明来自中国、尼日尔、法国和美国的片形吸虫分离株在线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并以pnad1序列进行种系发育研究,利用PCR扩增了中国、尼日尔、法国和美国片形吸虫分离株的pnad1序列并与GenBankTM中片形吸虫相应序列进行了比较,进行了种系发育分析.结果显示,所有片形吸虫样品的pnad1序列长度均为446 bp,中国、尼日尔、法国和美国肝片吸虫分离株与GenBankTM公布的肝片吸虫相应序列的种内变异为0.2%～0.7%,0.2%～0.9%,0.9%～2.0%,0.2%～0.9%;中国及尼日尔大片吸虫分离株与已报道的大片吸虫相应序列的种内变异为1.8%～2.7%,1.8%～3.4%;中国中间型虫株与中国及尼日尔大片吸虫分离株以及网上报道的大片吸虫的序列差异为5.6%～6.3%,5.6%～7.8%,5.7%～8.1%.中间型片形吸虫在遗传学上介于大片吸虫与肝片吸虫之间,但与大片吸虫的遗传关系更近.表明,片形吸虫pnad1序列可作为种间鉴定及种内遗传变异研究的标记;在中国的确存在中间型片形吸虫.     

表达Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株的构建

为构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒(GTPV)弱毒株,将Asia 1型FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因、蛋白酶3C基因、绿色荧光蛋白(EGFP)基因、痘苗病毒启动子(p7.5)相连,构建成一整体基因表达盒p7.5-EGFP-P12A3C.以GTPV胸苷激酶基因序列中的Kpn Ⅰ酶切位点为插入位点.将整体基因表达盒插入转移载体骨架pUC119-TK中,构建GTPV转移载体pTK-p7.5-EGFP-P12A3C.将转移载体转染GTPV弱毒株AV 41感染的BHK-21细胞,转染后24 h就可见到绿色荧光,表明,成功获得了能表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK-/EGFP+/FMDV P1-2A3C+/GTPV.     

牛病毒性腹泻病毒玛纳斯株E2基因的克隆及其主要抗原表位区的分段表达

应用RT-PCR方法扩增了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)新疆玛纳斯分离株的E2基因,应用软件对序列进行分析,预测了可能存在的抗原表位;分别扩增了包含预测抗原位点的片段(1～118)-(144～340)-(100～300)-(1～345),并将其克隆到pMD18-T Simple载体中;将重组质粒pMD-(1～118)、pMD-(144～340)、pMD-(100～300)、pMD-(1～345)的HindⅢ+Bam H Ⅰ双酶切产物分别插入pET28a(+),构建了原核表达载体pET-(1～118)、pET-(144～340)、pET-(100～300)、pET-(1～345).将这些原核表达载体分别导入BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE分析,结果显示,4个重组质粒在BL21(DE3)中均成功表达,表达融合蛋白的分子质量分别为18.6、28.2、29.2和43.9 ku,与预测蛋白质分子质量一致,Western-blot分析结果表明,28.2、29.2和43.9 ku的融合蛋白可被牛抗BVDV阳性血清识别.     

鹅IFN-α基因的高效表达

通过对鹅IFN-α成熟蛋白基因的分析,利用在线软件,将序列中稀有密码子改为优势密码子,优化了密码子适应性指数,更多地采用了利于表达的密码子对,优化了表达的起始区域和终止区域mRNA的二级结构及自由能.然后,将人工合成的鹅IFN-α基因与表达载体pWL连接后诱导表达.SDS-PAGE分析表明,所表达蛋白的分子质量为18.83 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的35.3%.表达产物以包涵体形式存在.复性、纯化后的鹅IFN-α重组蛋白的纯度达98%,活性达1.28×107U/mL.     

大通牦牛LF基因的克隆与分子特征

通过RT-PCR克隆了牦牛包含LF基因编码区的cDNA序列(GenBank登录号为EU547251);将克隆获得的LF基因的cDNA与乳牛相应序列进行了比对;对牦牛LF蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号为ACB29794)与其他物种的相应序列进行了比较,应用在线生物软件对牦牛LF蛋白的特性和结构进行了预测.结果表明,克隆获得的牦牛LF基因cDNA片段长度为2 344 bp,其中LF基因编码区全长2 124bp,编码708个氨基酸;克隆获得的牦牛cDNA序列与乳牛该序列存在15个碱基的变异;各物种LF蛋白具有较高的同源性,LF蛋白进化树符合物种进化规律;牦牛LF蛋白含有α-螺旋36.0%、β-折叠22.4%、β-转角31.1%、无规卷曲12.9%;同源建模预测的LF 3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成的2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由一段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈"二枚银杏叶型"结构.