猪瘟病毒E_2基因疫苗表达抗原在小白鼠胫前肌的分布及消长

用免疫组化法检测了猪瘟病毒（ＨＣＶ）Ｅ２囊膜糖蛋白基因疫苗表达的抗原在小白鼠胫前肌中的分布及消长。结果：ＨＣＶＥ２基因疫苗ｐＣＤＳＴ接种小白鼠胫前肌后,表达的Ｅ２抗原主要分布于肌纤维膜上,少量分布于肌纤维间,在细胞浆中很难检测到Ｅ２抗原;用ＨＣＶ基因疫苗免疫后１ｄ,Ｅ２抗原已有表达,１３ｄ抗原达高峰,以后逐渐减少,３０ｄ仅检测到少量抗原。     

基于布鲁氏菌Dps蛋白间接ELISA检测方法的建立与初步应用

为建立一种布鲁氏菌病早期快速诊断的血清学方法,进一步加强对布鲁氏菌病的防控.对布鲁氏菌Dps蛋白进行生物信息学分析、原核表达,将纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立了布鲁氏菌病血清学间接ELISA检测方法并进行初步应用.结果显示,当重组蛋白Dps包被量为0.25 μg,5％脱脂奶粉溶液封闭1.5 h,用稀释度为1∶1 0...     

轮状病毒VP4蛋白与热稳定肠毒素融合基因的克隆及其植物表达载体的构建

利用DNA重组技术,将用PCR扩增来的 VP4-ST融合基因分别克隆到原核表达载体pThioHisB及植物表达载体 pBin438 中,成功构建了重组表达质粒 pTh-VP4-ST和 pB-VP4-ST。将pTh-VP4-ST进行SDS-AGE分析,结果表明,表达的目的蛋白以包涵体形式存在,大小约 40ku;同时将pB-VP4-ST转化了农杆菌EHA105。     

犬瘟热病毒TN野毒株核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的犬瘟热病毒(CDV)Onderstepoort株核蛋白基因(N)序列,设计了1对特异性引物,用该引物对分离的TN野毒株进行了RT PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM T质粒连接,得到重组质粒pTN。经核苷酸序列测定,CDVTN株N基因的ORF全长1569bp,编码523个氨基酸;将TN野毒株与GenBank中收录的其他CDV毒株进行比较,N基因核苷酸序列的同源性为94%～99%,推导的N蛋白氨基酸序列的同源性为97%～99%。TN株与Onderstepoort疫苗株氨基酸序列的差异主要集中在N端(17～159位)和C端(408～519位),中间的区域则高度保守。此外,在CDVN蛋白N端281～289位上也发现存在与麻疹病毒(MV)N蛋白完全相同的Y P A L G L H E F9肽序列,推测可能是诱导CTL活性的靶蛋白的抗原表位之一。氨基酸组成分析发现,推导的N蛋白氨基酸序列中亮氨酸、丝氨酸和异亮氨酸所占比例很高,提示该蛋白具有高度螺旋和缠绕的分子结构。     

化学佐剂对猪瘟病毒E_2基因疫苗免疫增强作用的研究

以昆明小白鼠为试验动物,研究了化学佐剂对猪瘟病毒E2 囊膜糖蛋白( HCV E2) 基因疫苗的免疫增强作用;用印度墨水活体染色法筛选促进印度墨水在肌肉中扩散的化学试剂,并用筛选到的化学试剂与pCDLacZ 混合肌肉注射小白鼠。结果表明,斯苯和甘油能较好的促进LacZ 基因在小白鼠胫前肌中表达,提示斯苯和甘油可作为基因疫苗的化学佐剂;用斯苯和甘油按比例混合配制HCV E2 基因疫苗质粒pCDST 免疫小白鼠,其抗体效价显著高于蔗糖、甘油、斯苯单一佐剂。     

羊种布氏杆菌M5-90 DnaK的原核表达及免疫保护性研究

为对布氏杆菌DnaK基因的原核表达情况及免疫保护性进行分析,根据Gen Bank中公布的羊种布氏杆菌M5-90的DnaK基因序列,设计引物,合成DnaK基因片段,将其连接到p UC57载体测序;将DnaK基因克隆至原核表达载体pET-28a,转化入大肠杆菌DE3感受态细胞中诱导表达;用SDS-PAGE凝胶电泳对DnaK融合蛋白进行分析;利用AKTAxpress智能多维纯化系统进行纯化;用Western-blot分析其反应原性。将DnaK融合蛋白免疫小鼠,利用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IgG和IFN-γ水平。结果显示,获得pET-28a-DnaK重组表达质粒,大约在69.8 ku处出现DnaK融合蛋白条带;纯化后条带单一;DnaK具有较好的反应原性;DnaK融合蛋白可诱导小鼠血清产生抗体IgG和细胞因子IFN-γ。结果表明,DnaK融合蛋白可作为候选亚单位疫苗。     

单核细胞增生李斯特菌野毒株prfA基因的克隆及其分子特征分析

利用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(LM)TA野毒株prfA基因进行扩增,将其克隆后测序,并对该分离株prfA基因及其编码蛋白进行分子特征和遗传变异分析。结果显示,TA株prfA基因全长为714bp,编码237个氨基酸。通过对推导的prfA蛋白氨基酸序列结构域分析发现,该蛋白从N端到C端分别包括1个β-环结构域(18～97aa)、1个α-螺旋构成的C区(110～136aa)、1个α-螺旋构成的D区(136～155aa)、1个由螺旋-转角-螺旋构成的HTH结构域(170～196aa)和1个由α-螺旋构成的亮氨酸拉链G区结构域(211～237aa)。通过对GenBank中登录的35株分离株prfA基因遗传变异分析发现,不同地域分离株的prfA基因在核苷酸水平以点突变为主;TA株第197位氨基酸由赖氨酸(Lys,K)突变为天冬氨酸(Asn,N)。     

山羊遗传性甲状腺肿组织的病理学观察

山羊遗传性甲状腺肿病(简称“遗甲”)是一种遗传性代谢病。我国山羊“遗甲”是梅文辉等于1979年发现,并通过一系列研究初步证实为隐性“遗甲”病,其发病机理尚未完全阐明,超微结构变化还未见报道。(一)材料与方法 测交实验得到4只甲状腺肿羔羊,产下后数分钟或数小时内死亡。濒死前速取甲状腺肿组织一份,经2.5％戊二醛和1％四氧化锇双重固定,丙酮系列脱水,Epon812包埋剂包埋,LKB-5型超薄切片机切片,醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色,LMZ—5型透射电镜观察。另一份经10％中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,切片H.E染色,光镜观察。     

白细胞介素3对猪瘟病毒E_2基因疫苗免疫增强作用的研究

以昆明系小白鼠为试验动物,观察了白细胞介素３（ＩＬ３） 对猪瘟病毒Ｅ２ 囊膜糖蛋白（ ＨＣＶ Ｅ２） 基因疫苗免疫效果的增强作用。用ＤＮＡ 重组技术将ＨＣＶ Ｅ２ 基因和小白鼠ＩＬ３ 基因克隆到ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ 质粒,因在两者之间有脑心肌炎病毒（ＥＭＣＶ） 的核糖体进入位点（ＩＲＥＳ） 片段,可得到ＨＣＶ Ｅ２ 基因和小白鼠ＩＬ３ 基因双表达质粒ｐＩＲＳＴ ＩＬ３ ,用ｐＩＲＳＴＩＬ３ 免疫小白鼠后,经ＥＬＩＳＡ 法检测免疫小白鼠血清中抗ＨＣＶ Ｅ２ 抗体效价。结果显示,ＩＬ３ 能显著提高ＨＣＶ Ｅ２ 基因疫苗的免疫效果,表明ＩＬ３ 可作为ＨＣＶ Ｅ２ 基因疫苗的细胞因子佐剂。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。