H5、H7和H9亚型禽流感病毒液相芯片检测方法的建立

为应用液相芯片技术建立同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,在GenBank中收集H5、H7、H9亚型AIV的HA基因序列,利用DNAMAN软件分析比较筛选出特异的保守片段,设计引物和探针。将多重不对称RT-PCR扩增产物与偶联荧光微球的探针进行杂交,建立多重液相芯片方法。结果显示,多重液相芯片技术对H5、H7、H9亚型AIV核酸的最低检出量分别为18.5、28.7、20.7pg/μL,检测的特异性和重复性都很好,应用该方法和禽流感检测试剂盒双盲试验同时对50份已知病毒的样品进行了检测,两者符合率为100%。该方法为禽流感病毒核酸液相芯片的进一步研究奠定了基础。     

鉴别禽致病性大肠杆菌与禽非致病性大肠杆菌的多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速鉴别禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)与禽非致病性大肠杆菌(avian non-pathogenic Escherichia coli,ANPEC)的多重PCR检测方法,本研究针对APEC的iss、cvaC、irp2、iucD、iroN和tsh共6个毒力基因的序列进行分析,分别设计合成6对特异性引物,通过正交组合法优化引物比例和梯度法确定最佳退火温度,并进一步完善方法的敏感性、特异性和判定标准,建立了一种快速灵敏检测APEC的多重PCR检测方法,并初步应用该方法对本实验室102株大肠杆菌样本进行鉴定和分群。结果显示,该多重PCR方法对菌液最低检测浓度为5×107CFU/m L;对其他种属的4株革兰阳性菌和5株革兰阴性菌无扩增。检测实验室保存的鸭源APEC和ANPEC各10株,通过比较两者所含毒力基因的分布情况及数量,建立了多重PCR判定标准即所含毒力基因数大于等于3者为APEC阳性菌株。初步应用该方法检测实验室分离保存的23株APEC和79株ANPEC,同时进一步验证了其准确性。结果表明,APEC检出率为100%,ANPEC的检出率亦为100%。以上结果充分说明本研究建立的多重PCR特异性强、灵敏度高、简便快捷,可进一步应用于禽类的APEC与ANPEC的快速鉴别诊断和APEC的分子流行病学调查。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN/XT/07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。     

五种禽呼吸道病病原多重PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡毒支原体(MG)的基因序列,设计了5对特异性引物,建立了分别针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断方法,并进行了退火温度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度的优化,以及特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明,设计的5对引物对同一样品中的RNA(AIV、NDV、IBV)和DNA(ILTV、MG)进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp(AIV)、321bp(NDV)、457bp(IBV)、662bp(ILTV)和732bp(MG);建立的多重PCR方法具有较强的特异性和较高敏感性,能检测出1pgAIV、1pgNDV、10pgIBV的RNA和1pgILTV、10pgMG的DNA。对鸡临床样品的检测结果证明,该方法在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

猪流感病毒一步法荧光定量RT-PCR诊断方法的建立

为了建立一种在猪流感流行病学调查和临床诊断中应用的快速高效的诊断方法,根据猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)M基因的保守序列,设计并合成1对特异性引物和1条特异性TaqMan探针,建立了以RNA为反应模板的一步法荧光定量RT-PCR诊断方法。使用含有M基因的重组质粒作为标准品绘制标准曲线,该曲线效率值为2.014,误差值为0.005。试验结果表明,该方法灵敏度极高,最低可检测到10 copies的核酸;临床样品检测结果也显示其灵敏度高于普通PCR和病毒分离法;特异性强,对猪群常见的其他6种病毒检测结果均为阴性。临床样品检测显示,该方法操作简单,可以用RNA作为模板直接检测,节省时间,而且特异性好、灵敏度高,是可以应用于猪流感流行病学调查的一种可靠的诊断方法。     

猪细小病毒、猪圆环病毒2型和伪狂犬病病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)核苷酸序列,分别设计并合成了3对特异性扩增PPV、PCV2和PRV的引物,扩增片段长度分别为531、466和277bp。经过优化条件,建立了检测PPV、PCV2和PRV的多重PCR方法。采用该PCR方法对23份自然感染病猪样品进行检测,结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果的符合率为100%,同时对临床样品中PPV、PCV2和PRV阳性PCR产物进行测序分析,发现PPV、PCV2和PRV的PCR产物序列与GenBank中公布序列的同源性均达98%以上,证实该多重PCR检测的阳性结果为上述3种病毒。表明,建立的多重PCR方法可用于这3种病毒的临床诊断和流行病学调查。     

AQP9基因在不同闭锁进程水牛卵泡颗粒细胞中的表达及其与细胞凋亡关系的研究

为了解AQP9基因表达及其与水牛颗粒细胞凋亡的关系,初步阐明它在水牛卵泡闭锁中的作用,首先分析了不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞中AQP9基因和凋亡相关基因的表达情况。通过构建颗粒细胞凋亡模型、过表达AQP9基因的方法分析了它对细胞凋亡相关基因表达的影响。为进一步了解PKC通路与AQP9基因表达的相关性,添加PKC抑制剂处理水牛颗粒细胞,分析细胞凋亡和基因表达情况。上述研究结果表明,AQP9基因主要参与早期卵泡闭锁的过程,AQP9基因可能通过PKC信号通路调节水牛颗粒细胞的凋亡。     

扩展莫尼茨绦虫烯醇化酶基因的克隆及其组织表达差异分析

为了探索烯醇化酶基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用,通过基因质粒文库克隆分析了扩展莫尼茨绦虫烯醇化酶基因mRNA的全长序列,同时应用SYBRGreenreal-timeRT-PCR方法检测了该基因在虫体4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节的组织表达差异。序列分析结果表明,该基因全长1691bp,编码445个氨基酸,蛋白的理论分子质量为48.94ku,等电点为5.56,是含有螺旋和不规则卷曲较多的疏水性蛋白。相似性分析结果显示,其基因表达产物与肝片吸虫氨基酸的相似性达74.8%,属于磷酸丙糖异构酶磷酸盐结合蛋白家族。Real-timeRT-PCR结果表明烯醇化酶基因在虫体各发育阶段的表达丰度差异显著,其从高到低依次为成节、幼节、孕节和头节。据此推测该烯醇化酶基因在虫体寄生过程中对细胞内物质的代谢与能量的产生起关键作用。     

新时期中国外交思想、战略和实践的探索创新

新时期中国外交在继承传统的同时加大了探索和创新力度,体现出多重属性的大国外交思想、与时俱进的战略思维和积极进取的外交实践。以习近平同志为总书记的领导集体大力推进中国特色外交思想和战略建设,丰富了中国的大国外交实践,指引着中国大国外交运筹和发展方向。然而,中国前进的道路不可能一帆风顺,中国在外交理论、战略和实践上要始终保持高度警惕,特别是不能犯重大错误。未来中国外交在理论建设方面需要更加系统,在战略思维方面需要更加缜密,在政策举措方面需要更加周全,在舆论引导方面需要更加超前,争取在外交工作上取得更大成就。     

不同动物源性大肠杆菌多重耐药调控基因rob的同源性分析

为研究大肠杆菌多重耐药调控基因rob与不同动物源性及多重耐药水平之间的关系,选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌5株及大肠杆菌药敏质控株ATCC25922,在对其进行主要治疗药物耐药性检测的基础上,分别以其染色体DNA为模板,通过PCR反应扩增出大肠杆菌多重耐药调控基因rob,将该基因分别与克隆载体pMD18-T连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,对经酶切与PCR反应鉴定为阳性的克隆质粒进行了核苷酸序列测定。测序结果表明:不同动物源性大肠杆菌的rob基因与Gen-Bank中该基因的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列的同源性较高。不同源性大肠杆菌的rob基因的核苷酸序列与其动物源性有关,该基因的核苷酸序列的个别突变位点可能影响AcrAB外输泵的表达水平,进而影响其多重耐药水平。