口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术,扩增出口蹄疫病毒(FMDV)VP2基因,并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞,获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后,感染sf9细胞,表达VP2融合蛋白,分子质量为33 ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体,通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定,说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达,且可以与牛抗O型FMDV血清发生特异性反应。     

CELO病毒fiber1基因部分片段的原核表达及抗原性鉴定

根据鸡胚致死孤儿(CELO)病毒Phelps株的fiber1基因(GenBank序列号U46933)序列设计了1对引物,采用PCR扩增CELO病毒fiber1基因C端(包含Knobs区)的部分片段,并将其克隆到质粒表达载体pGEX6p1,获得的阳性克隆命名为pGEXAF807。序列分析表明,所获得的DNA片段核苷酸序列与CELO病毒Phelps株的fiber1基因序列完全一致。将pGEXAF807转化大肠埃希氏菌DH5α,经37℃、0.6mmol/LIPTG诱导表达5h,SDSPAGE分析超声裂解后的上清和沉淀。结果显示,目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为54.6ku,目的蛋白量占菌体总蛋白的35.7%。用CELO病毒多克隆血清做Westernblotting试验,结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆与原核表达

根据GenBank中旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Tsserpin)基因序列设计1对引物,从旋毛虫肌幼虫提取总RNA,应用RT-PCR扩增获得目的基因片段,进行限制性酶切后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-Tsserpin,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,经PCR、限制性酶切分析及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行了诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,表达产物纯化后用Western-blotting鉴定Tsserpin重组蛋白的抗原性。PCR与酶切鉴定结果显示,构建的重组表达质粒pET30a-Tsserpin与预期结果一致。测序结果表明,插入片段为1122bp,编码373个氨基酸,与GenBank中旋毛虫Tsserpin基因的相似性为99%。含有pET30a-Tsserpin重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE分析结果显示,表达产物的分子质量约为48.5ku,而且主要以包涵体形式存在。Western-blot分析结果表明Tsserpin重组蛋白可以被旋毛虫感染猪阳性血清特异性识别,提示其具有良好的抗原性,可以作为猪旋毛虫病免疫诊断的候选抗原。     

柔嫩艾美球虫pEtK2抗原基因的克隆表达及其表达产物的抗原性分析

应用RT-PCR技术从纯化的柔嫩艾美球虫孢子化卵囊子孢子中克隆了pEtK2抗原基因,并进行了原核表达和抗原性分析,同时用MTT法检测了重组蛋白对球虫耐过鸡淋巴细胞的刺激效果。结果显示,克隆的pEtK2基因全长1464 bp,具有一个完整的开放阅读框,编码487个氨基酸,具有多个T细胞表位。重组蛋白诱导5 h后表达量最多,分子质量约55 ku,占菌体总蛋白的32%。纯化的重组蛋白能够刺激球虫耐过鸡T淋巴细胞增殖,可作为球虫基因工程疫苗或DNA疫苗的候选基因。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法,以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因,克隆至pGEM-T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定,gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后,Western-blotting和ELISA分析结果表明,这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应,可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

伯氏疏螺旋体外膜蛋白C的表达及抗原性分析

以伯氏疏螺旋体SZ(B.garinii)、BO23(B.afzelii)、B31(B.burgdorferi sensu stricto)菌株的外膜蛋白OspC基因为靶基因,将PCR扩增出的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中构建重组质粒进行表达,表达的蛋白用MagneGSTTMProtein Purification System纯化,之后用此3株菌株免疫羊制备的阳性血清做Western-blot,检测该重组蛋白。证明这3个基因型菌株的重组OspC具有抗原性及交叉反应性。本研究表达的重组蛋白OspC(SZ菌株)为建立羊体内伯氏疏螺旋体抗体的ELISA检测方法奠定了基础。     

犬瘟热病毒昆明分离株的生物学特性

从1只曾接种过犬瘟热弱毒疫苗但又发病的宠物犬血样中分离到1株犬瘟热病毒(CDV),命名为CDV昆明分离株(CDV-KM)。该毒株可使Vero细胞产生以细胞融合及空泡化为特征的细胞病变,病毒效价为105.8TCID50/mL或1.76×106PFU/mL,并能在鸡胚绒毛尿囊膜、鸡胚成纤维细胞及MDCK细胞上增殖。微量中和试验结果发现,自制的犬抗CDV-KM株同份血清对CDV-KM株与参考毒株CDV-Onder-stepoort的中和抗体效价即半数保护量分别为1:142和1:132,显示二者未存在明显的中和表位差异。RT-PCR、RFLP和DNA测序分析结果显示,使用参照组合引物CDV-P2/P3/P4扩增,均可得到被认为指示弱毒株特征的177bp核酸片段;而H蛋白全长基因扩增产物未见能指示野生毒株特征的NdeⅠ和SspⅠ酶切位点;H蛋白基因与Onderstepoort小空斑变异株、鸡胚适应株和大空斑变异株的核酸序列同源性分别为98.84%、98.90%和100%。表明该分离株属于疫苗基因群。     

鹅细小病毒vp1基因的原核表达及抗原性分析

将鹅细小病毒(GPV)H1株vp1基因从pMD18T-vp1亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1的多克隆位点,构建了原核表达载体pGEX-6P-vp1,将其转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了108ku的融合蛋白,该融合蛋白经亲和层析纯化并经Western-blot检测。结果表明,纯化的融合蛋白可与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

旋毛虫TsP53抗原基因的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫总RNA中获得TsP53基因片段,限制性酶切后连接到表达质粒pET30a中,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR分析及测序鉴定后,将重组表达质粒pET30a-TsP53转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,对表达产物纯化后通过间接ELISA鉴定重组蛋白的抗原性。结果显示,成功构建了重组表达质粒pET30a-TsP53,测序结果表明插入片段为1 176 bp,编码391个氨基酸残基,与旋毛虫P53抗原基因序列(U25127)有99%的同源性,开放阅读框正确。含有pET30a-TsP53重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子质量约为50 ku,主要以包涵体形式存在。间接ELISA结果表明,重组抗原可以被旋毛虫感染不同时期的猪血清特异性识别,有望用于旋毛虫病的免疫诊断。     

我国新城疫强毒株F糖蛋白基因的体外合成及其抗原性研究

将我国新城疫强毒株Ｆ４８Ｅ９在ＳＰＦ鸡胚增殖后提取ＲＮＡ，用自行设计的一对寡聚核苷酸引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，合成了Ｆ糖蛋白基因片段。将此片段与ｐＵＣ１９质粒重组，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，从阳性克隆中提取重组质粒，再用ＰＣＲ法扩增，获得了同样大小的ＤＮＡ片段。经用特异性抗体探针检测，证明该片段在大肠杆菌中的表达产物具有良好的抗原性