绵羊子宫内膜上皮细胞的培养鉴定及enJSRV囊膜蛋白及其受体Hyal2的瞬时表达

为了分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞并瞬时表达内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)囊膜蛋白及其受体(Hyal2),采用酶消化法分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞,差速消化法纯化细胞。应用角蛋白抗体对细胞进行免疫细胞化学鉴定。扩增enJSRVenv基因及其受体Hyal2基因,并构建真核表达质粒,同时在Hela细胞中瞬时表达。结果显示,细胞在相差显微镜下呈明显的上皮样细胞形态,同时细胞角蛋白染色阳性细胞占90%以上。成功构建了真核表达质粒pcDNA4-enJSRVenv及pcDNA4-Hyal2。Western-blot结果显示,真核表达质粒在HeLa细胞中被成功表达。本研究建立了一套高效、简便的子宫内膜上皮细胞培养方法,同时为进一步探究enJSRV囊膜蛋白的结构和功能奠定了试验基础。     

靶向enJSRV env基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效率的测定

为探讨绵羊内源性反转录病毒(enJSRV)在绵羊胚胎发育过程中的作用,利用脂质体将pEGFP-C1空载体转入绵羊绒毛膜滋养层细胞中,测定其转染效率。同时构建抑制enJSRV env基因的RNA干扰质粒,并将其转染到能稳定表达enJSRV env基因的绵羊绒毛膜滋养层细胞中,通过荧光定量PCR检测其干扰效率。结果显示,重组干扰质粒enJRSV-env-shRNA-1、enJRSV-env-shRNA-2、enJRSV-env-shRNA-3、enJRSV-env-shRNA-4、Negative-shRNA构建成功。Lipofectamine LTX脂质体体积为6.0μL,转染混合物体积为100μL,转染48h组的转染效率最高,为42.37%。与正常对照组细胞的enJSRV-env mRNA表达量相比,转染靶基因干扰质粒的各组绵羊绒毛膜滋养层细胞中enJSRV-env mRNA表达量分别下调了73.56%、66.82%、33.66%和18.16%。筛选出了一个干扰效率最高的RNA干扰质粒enJRSV-env-shR-NA-1,为以后包装慢病毒及进行动物试验来揭示enJSRV的生殖生物学作用奠定了坚实的基础。     

蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA相对表达水平的实时荧光定量PCR检测

为了检测培养的蒙古绵羊输卵管上皮细胞内sBD-1 mRNA表达水平,运用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术进行了相对定量测定.首先,建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外试验模型,提取细胞总RNA,根据GenBank中羊β-防御素基因序列,设计合成引物,进行实时荧光定量PCR.以β-Actin基因为内参基因,对sBD-1 mRNA进行均一化处理,利用荧光阈值(C2值)计算sBD+1 mRNA的相对表达量.经测序分析,扩增产物为β-防御素.结果显示,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素mRNA表达水平的相对含量.     

脂多糖诱导奶牛子宫内膜上皮细胞核因子κB的表达

通过研究脂多糖(LPS)诱导奶牛子宫内膜上皮细胞核因子κB亚单位P65蛋白mRNA的表达变化,从细胞水平深入探讨子宫内膜炎的发病机理。将奶牛子宫内膜上皮细胞传代培养,采用1、10、50、100、1000μg/mL五个浓度梯度的LPS刺激子宫内膜上皮细胞,MTT法筛选最佳刺激浓度;以上述最佳刺激浓度刺激细胞,于0、0.5、1、2、4h后收集细胞,荧光定量RT-PCR检测p65 mRNA的表达差异性。结果显示,100μg/mLLPS为最佳刺激浓度;LPS刺激1h组p65 mRNA的表达极显著(P0.01)高于其他时间组;2h组显著(P0.05)高于0、0.5和4h组;0.5和4h组显著(P0.05)高于0h组。结果表明,LPS可诱导奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB的激活,LPS介导的NF-κB信号通路存在于奶牛子宫内膜上皮细胞中,并参与子宫内膜炎发病机理的调控。     

妊娠期绵羊子宫内膜Fit-1基因表达的RT-PCR检测

以β-actin基因作为内源性内标,采用RT-PCR方法检测了Flt-1基因mRNA在东北细毛羊、小尾寒羊妊娠期不同阶段子宫内膜中的表达量.结果显示,绵羊妊娠期在不同阶段的子宫内膜中Flt-1 mR-NA均强烈表达,且随着妊娠期的延长,Fit-1 mRNA的表达量有逐渐增强的趋势(P＜0.05);在相同的妊娠阶段小尾寒羊子宫内膜中的Flt-1 mRNA表达量显著地高于东北细毛羊的Flt-1 mRNA表达量(P＜0.05).     

雌激素受体在间情期绵羊输卵管上皮细胞中的表达

为探讨膜性雌激素受体GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1)及雌激素核受体ERα、ERβ在绵羊输卵管上皮细胞中的表达和定位,探讨三种受体在间情期绵羊输卵管中的表达规律,通过RT-qPCR方法和免疫印迹方法分别检测了三种受体基因mRNA水平和蛋白水平的表达差异;运用免疫组化法对输卵管组织中三种受体基因进行定位并对结果进行光密度值分析。结果,输卵管上皮细胞中GPER相对表达量高于ERα、ERβ(P0.01),ERα的相对表达量高于ERβ(P0.05)。免疫组化结果显示,GPER广泛分布于绵羊输卵管上皮细胞中,主要定位于细胞膜及细胞质。而ERα及ERβ主要分布于绵羊输卵管上皮细胞的细胞核。阳性细胞光密度分析结果与荧光定量RT-qPCR的分析结果相一致。上述结果表明,间情期绵羊输卵管上皮细胞中同时存在GPER、ERα、ERβ三种雌激素受体表达,且GPER的平均光密度、mRNA相对表达量最高,ERβ的平均光密度、mRNA相对表达量最低。     

胰岛素样生长因子及其受体mRNAs在绵羊生殖系统中的表达和分布

为检测胰岛素样生长因子(IGFs)及其受体(IGFR)mRNAs在绵羊发情周期早期卵巢、子宫和输卵管中的表达,探讨绵羊胚胎早期发育过程中其发育环境——生殖道中生长因子的表达、分泌及其作用,取绵羊发情周期早期卵巢、子宫和输卵管,经固定、切片、免疫染色,观察IGFs mRNAs的表达和分布情况。同时用RT-PCR技术研究了各组织中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR、IGF-ⅡR mRNAs的表达情况。结果表明,IGFs mRNAs在绵羊发情周期早期的卵巢、子宫和输卵管中都有表达,4种因子表达模式相似:在卵巢中,IGFs主要定位于卵泡颗粒细胞,间质细胞亦有少量表达。在输卵管中,上皮细胞免疫染色呈阳性;在子宫中,腺细胞及上皮细胞的阳性信号强于固有层。RT-PCR检测表明IGFs mRNAs在3种组织中均有表达。     

绵羊生殖器官GDF9基因的表达研究

生长分化因子9(GDF9)是绵羊多胎性状的重要候选基因,探讨GDF9在不同发育时期的母羊生殖器官的表达规律,对揭示其调控母羊生殖器官的发育具有重要的意义。以2月龄(性成熟前)、6月龄(性成熟)和12月龄(性成熟后)这3个不同生理阶段的雌性绵羊卵巢、输卵管、子宫内膜为对象,采用RT-PCR技术分析GDF9蛋白在相应生殖器官中的表达,并分析其相对表达量;采用免疫组织化学法对GDF9基因在相应生殖器官中的表达进行定位分析。荧光定量PCR结果显示,GDF9在2月龄与6月龄间、2月龄与12月龄间的卵巢上均表现出极显著的差异性(P0.01),而6月龄与12月龄则无显著性差异(P0.05);GDF9在2月龄与6月龄间的子宫内膜上表达无显著差异(P0.05),而在2月龄与12月龄间、6月龄与12月龄间的子宫内膜上的表达均差异显著(P 0.05);GDF9在3个年龄间的输卵管上的表达均无显著性差异(P0.05)。免疫组织化学试验结果显示,GDF9蛋白在2月龄、6月龄和12月龄绵羊子宫内膜和输卵管的上皮细胞及卵巢的颗粒细胞上均能表达,说明GDF9在不同生理阶段的绵羊生殖器官上表达且存在特异性细胞定位。     

FGF2和FGFR在牦牛繁殖周期子宫的表达与定位

为探索成纤维细胞因子2(fibroblast growth factor,F2GF2)及成纤维细胞因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)在健康成年牦牛繁殖周期中的生物学功能,本研究选取了不同繁殖周期(发情期-卵泡期、发情期-黄体期、妊娠期-黄体期)牦牛子宫组织,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和免疫组织化学方法从基因和蛋白水平分别检测不同繁殖周期牦牛子宫FGF2和FGFR的表达和分布,用积分光密度方法分析FGF2和FGFR蛋白表达水平。结果显示,不同繁殖周期牦牛子宫中FGF2mRNA表达水平为:发情期-卵泡期发情期-黄体期妊娠期-黄体期(P0.01);FGFRmRNA表达水平为:发情期-黄体期妊娠期-黄体期发情期-卵泡期(P0.05)。FGF2和FGFR在牦牛不同繁殖周期的子宫内膜、子宫腺及血管上皮中均有表达,子宫内膜和子宫腺为主要表达部位,阳性细胞的细胞质中表达较高。积分光密度分析结果显示,FGF2蛋白表达水平为:发情期-卵泡期子宫发情期-黄体期子宫妊娠期-黄体期子宫;FGFR蛋白表达水平为:妊娠期-黄体期子宫发情期-卵泡期子宫发情期-黄体期子宫。以上结果表明,FGF2和FGFR在不同繁殖周期的表达差异性可能与其参与早期胚胎附植及胚胎发育的调控相关,这为进一步研究FGF2和FGFR在牦牛繁殖周期中的调控作用提供了理论依据。     

TLR3参与新孢子虫致怀孕小鼠胎盘的炎性损伤

为探究TLR3是否参与了新孢子虫致小鼠胎盘的炎性损伤,本试验将2×106新孢子虫Nc-1株速殖子通过腹腔注射给怀孕7.5 d的C57BL/6小鼠,利用病理组织切片、免疫组化和荧光定量PCR等方法检测小鼠胎盘组织中TLR3及其相关细胞因子表达水平。结果显示,在小鼠感染新孢子虫后第2、5、8 d小鼠胎盘组织分别出现了不同程度的坏死、炎性细胞浸润和细胞核变形崩解等病理损伤;免疫组化结果显示,新孢子虫感染组的小鼠胎盘内巨细胞层、海绵滋养层和迷路滋养层细胞TLR3的表达量均明显增多;荧光定量PCR结果显示,感染组小鼠胎盘中TLR3 m RNA的表达量显著高于对照组(P0.05),是对照组的2.5～4倍,与免疫组化检测结果基本一致;感染组小鼠胎盘中TNF-α、IFN-γ和IL-2 m RNA的相对表达水平分别是对照组的1.5～3倍、4～5倍和2～3倍,差异均显著(P0.05)。结论,新孢子虫感染可显著上调小鼠胎盘内TLR3的表达量,进而使TLR3介导的炎性细胞因子的表达量升高,参与新孢子虫致怀孕小鼠胎盘的炎性损伤,该研究为进一步揭示新孢子虫的致病机理提供了重要数据。     

内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒的研究进展

从内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒(enJSRV)与外源性绵羊肺腺瘤反转录病毒(exJSRV)基因组结构的比较、enJSRV与绵羊肺腺瘤病(OPA)的关系、enJSRV在羊体内的表达及其系统发育分析等方面综述了enJSRV的研究进展,旨在为早期诊断及预防OPA提出新方法,为揭示该病的分子发病机理及探索其基因治疗提供新思路。     

间隙连接蛋白Cx43和Cx45在体外受精绵羊早期胚胎中的表达

为了研究间隙连接蛋白Cx43和Cx45在体外受精绵羊胚胎早期发育过程各阶段的表达情况,利用RT-PCR扩增得到绵羊Cx43(43 ku)及Cx45(45 ku)基因的mRNA,并进行序列测定。收集绵羊未成熟和成熟卵母细胞以及体外受精早期胚胎各发育阶段的卵裂球细胞,通过RT-PCR半定量检测Cx43和Cx45基因的mRNA表达量;通过免疫组织化学方法结合激光扫描共聚焦显微镜检测Cx43和Cx45蛋白在绵羊体外受精的早期胚胎发育过程中的表达情况及表达区域。结果表明,在绵羊卵母细胞成熟过程以及早期胚胎发育的各个时期,Cx43及Cx45在mRNA水平和蛋白水平均有表达;Cx43、Cx45蛋白主要分布在细胞膜表面,在细胞质和细胞核中表达微弱。研究结果为进一步探索Cx43和Cx45在绵羊早期胚胎发育过程中的作用提供了试验数据。     

鸡β防御素2成熟肽基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性分析

为构建基因重组酵母菌株表达鸡β防御素2(Gal-2)并研究其抗菌活性,将鸡β防御素2成熟肽基因克隆到pPIC9K中,获得重组分泌表达质粒pPIC9K-Gal-2并用电转化法转入酵母菌GS115,筛选出阳性克隆后用甲醇诱导,表达上清经Tricine-SDS-PAGE和抑菌试验检测,最后通过禽致病性大肠杆菌CVCC1565感染雏鸡,研究表达上清的预防效果。结果表明,重组分泌表达质粒pPIC9K-Gal-2构建成功,Tricine-SDS-PAGE检测到分子质量在5.8ku左右的目的条带,表达上清能抑制包括2种禽致病菌在内的多种细菌的生长;在禽致病性大肠杆菌感染雏鸡的试验中,注射不同浓度的Gal-2表达上清组与空酵母表达上清组、PBS对照组相比,死亡率均极显著降低(P<0.01),表达上清显示了较好的预防效果。该研究成功构建了表达鸡β防御素2的毕赤酵母菌株,为鸡防御素作为新型饲料添加剂的研发提供了基础。     

egr-miR-71过表达对绵羊PBMCs蛋白组的差异表达分析

为了探究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)来源的miR-71(egr-miR-71)对绵羊外周血单核细胞(PBMCs)蛋白组的影响。本研究使用密度梯度离心法分离得到绵羊PBMCs,并使用电穿孔法将egr-miR-71转染至绵羊PBMCs,用qPCR检测转染效率。基于iTRAQ方法,对比分析egr-miR-71过表达对绵羊PBMCs蛋白表达的影响,通过qPCR和Western-blotting对骨髓源性生长因子(MYDGF)转录水平和翻译水平进行验证。结果显示,绵羊PBMCs转染egr-miR-71模拟物后,miR-71的相对表达量极显著上调(P<0.01)。利用iTRAQ共鉴定出7642个蛋白质,其中157个呈差异表达,与对照组相比,68个蛋白显著上调,89个蛋白显著下调。下调的蛋白主要包括巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MYDGF、酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)和碳酸酐酶(CAs)等。这些差异蛋白主要参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、转化生长因子-β(TGF-β)等信号通路。qPCR和Western-blotting结果显示,与对照组相比,模拟物转染组中MYDGF转录和翻译水平均显著下调(P<0.05)。通过对转染egr-miR-71后绵羊PBMCs的蛋白进行组学分析,初步了解了egr-miR-71对绵羊PMBCs表达蛋白的调控,鉴定出的差异蛋白可能在细粒棘球蚴与宿主互作中发挥重要作用。这为深入研究细粒棘球绦虫的感染机制提供了思路,也为新型抗包虫病药物的研发提供了理论依据。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区原核表达载体的构建及表达

用RT PCR技术对猪瘟兔化弱毒C株、石门强毒株 (Shimen)、近期地方流行的属于第 1群毒株的新疆毒株 (XJ)和第 2群代表毒株甘肃临洮 (LT)株E2基因的主要抗原区进行扩增 ,均得到约 5 6 1bp的基因片段 ;经克隆测序及序列分析 ,该基因编码 187个氨基酸残基 ,预计蛋白分子质量为 2 1.7ku。将这 4个基因分别克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1中 ,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中 ,阅读框是正确的 ,从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL2 1(DE3)中 ,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG )进行诱导表达 ,对表达的蛋白用SDS PAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析。结果表明 ,E2基因的主要抗原区可以在大肠埃希氏菌中表达 ,表达的蛋白多以包涵体形式存在 ,表达产物的分子质量约为 5 0 .0ku ,与理论推测的分子质量一致 ;薄层凝胶扫描分析表明 ,表达蛋白约占菌体蛋白总量的 2 0 .1% ;免疫印迹结果证明 ,表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物,以重组pMD-T-VP1阳性质粒为模板,扩增获得了VP1基因,通过酶切将其克隆至表达载体pQE-Trisystem上。经测序证实,重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE-VP1转化至大肠埃希氏菌M15,通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达,SDS- PAGE和Western-blot分析表明,表达产物大小与预期的结果(26 ku)一致,且具有良好的反应原性。以2 mmol／L IPTG诱导表达5 h时表达量最高,其中70％-80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中,表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

L-PGDS基因在大鼠睾丸与附睾中的表达

选用 2月龄SD大鼠睾丸与附睾总RNA为模板 ,运用RT PCR和蛋白质印迹技术探讨了Lipocalin型前列腺素D合成酶 (L PGDS)基因在大鼠睾丸与附睾头、附睾体和附睾尾中的表达及其差异。结果表明 ,L PGDS基因在大鼠睾丸中没有表达 ,在附睾中有较强表达 ,附睾头表达量最高 ,附睾体次之 ,附睾尾最低 ,表达量存在差异。提示 ,L PGDS在精子成熟过程中起着一定的作用。     

致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86 fedA基因的克隆与原核表达

以致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86的基因组DNA为模板,对去掉信号肽的456bp的fe-dA基因进行了PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ与EcoRⅠ位点之间,经酶切鉴定与测序,在大肠杆菌中以IPTG诱导表达,并对表达产物用SDS-PAGE和Western-blot分析进行验证。结果表明,筛选出的阳性质粒pGEX-fedA-2(pfedA)经测序并与GenBank中收录的M61713序列进行比较,证明插入序列及读码框正确;表达产物GST-FedA经SDS-PAGE分析大小约42.4ku,Western-blot分析证实其具有良好的反应原性。所构建的原核表达载体可大量表达抗原蛋白,为进一步研究猪水肿病亚单位疫苗奠定了基础。     

鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达

采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒(GPV)的检测抗原,利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VP1与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP(1-3),分别转染sf9细胞,得到重组病毒,分别表达出了54 ku的NS2融合蛋白和24 ku的VP(1-3)融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实,表达产物具有特异性;间接免疫荧光试验证实,重组蛋白在细胞中获得了表达。     

基于高通量测序的多房棘球蚴感染小鼠肝组织中差异circRNA的生物信息学分析

分析多房棘球蚴感染小鼠肝组织中差异表达的环状RNA(circRNA),探究circRNA在宿主感染过程中可能参与的调控作用。采用高通量circRNA芯片技术比较感染组和对照组小鼠肝组织circRNA表达谱的差异,利用生物信息学对差异circRNA亲本基因进行GO和KEGG富集分析。结果显示,上调表达的circRNA有201个,下调表达的circRNA有9个,差异表达共计210个,经实时荧光定量PCR验证出其中4个上调和2个下调差异circRNA的表达水平变化趋势与芯片结果相一致。GO富集分析显示,在分子功能、生物过程及细胞组分均有富集;KEGG富集通路则有内吞作用、SNARE蛋白相关囊泡运动、矿物质吸收等与免疫相关的信号通路。结果提示,感染多房棘球蚴的小鼠肝组织与对照组小鼠肝组织比较,circRNA表达谱发生了显著性变化,这些差异表达的circRNA及其潜在的靶分子可能与多房棘球蚴感染宿主早期免疫反应有关。