益于猪圆环病毒2型增殖的PK-15细胞系的克隆筛选与应用

通过有限稀释法对被猪圆环病毒2型(PCV2)感染的PK-15细胞进行2轮细胞克隆筛选,得到1株对PCV2高度易感且稳定的同源性PK-15细胞克隆株,以提高PCV2在PK-15细胞系中的感染效价。结果显示,利用间接免疫荧光试验(IFA)从成功获得的7株PK-15细胞克隆株中筛选得到3株荧光反应较强的PK-15细胞克隆株。通过IFA、半定量PCR和Western-blotting等方法确定PCV2可以在PK-15细胞克隆株2中高效克隆并表达PCV2 Cap蛋白。QPCR结果表明,PCV2感染该PK-15细胞克隆株后第48小时病毒表达量达到最高。这证实,获得的高敏感性PK-15细胞克隆株2可用于持续产出高效价的PCV2以便于相关疫苗和诊断制剂的研制。     

益于猪圆环病毒2型增殖的PK-15细胞系的克隆筛选与应用

通过有限稀释法对被猪圆环病毒2型(PCV2)感染的PK-15细胞进行2轮细胞克隆筛选,得到1株对PCV2高度易感且稳定的同源性PK-15细胞克隆株,以提高PCV2在PK-15细胞系中的感染效价。结果显示,利用间接免疫荧光试验(IFA)从成功获得的7株PK-15细胞克隆株中筛选得到3株荧光反应较强的PK-15细胞克隆株。通过IFA、半定量PCR和Western-blot等方法确定PCV2可以在PK-15细胞克隆株2中高效克隆并表达PCV2 Cap蛋白。QPCR结果表明,PCV2感染该PK-15细胞克隆株后第48小时病毒表达量达到最高。这证实,获得的高敏感性PK-15细胞克隆株2可用于持续产出高效价的PCV2以便于相关疫苗和诊断制剂的研制。     

湖南地区猪圆环病毒2型的分离与鉴定

为分离鉴定湖南地区2个猪场的猪圆环病毒2型(PCV2),从临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪体采集组织病料,验证为PCV2感染的病料,用无污染猪肾细胞系(PK15)细胞分离培养。采用间接免疫荧光试验(IFA)、分子克隆及生物信息学等方法对分离病毒进行分析。结果显示,分别获得了2株PCV2:1株为PCV2d(命名为ChenZ-2-1,GenBank号MH718995),另1株为PCV2b(命名为Yi Y-3-27,GenBank号KU317482),且两分离株的病毒效价TCID50分别为1×10~(5.66)/mL和1×10~(5.5)/mL。本研究有利于提高PCV2的诊断水平,对深入研究PCV2的发病机理及开发PCV2新型疫苗奠定基础。     

猪断奶后多系统衰竭综合征诊断方法及标准的建立

猪断奶后多系统衰竭综合征 (PMWS)是一种由猪圆环病毒 2型 (Porcinecircovirus 2 ,PCV2 )引起的新病。PCV是 1974年在猪肾传代细胞系PK 15中发现的一种污染病毒 ,该病毒不产生细胞病变效应(CPE) ,无致病性 ,命名为PCV1;而后在PMWS中分离的猪圆环病毒 ,有致病性 ,命名为PCV2。PM     

猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其免疫组织化学研究

通过杂交瘤技术制备猪瘟病毒单克隆抗体,对酶联免疫吸附试验筛选的阳性单克隆抗体进行免疫组织化学研究,从中发现1株单克隆抗体能与感染猪瘟病毒的猪肾、肝病理组织切片及PK15细胞产生特异性染色反应,与非感染猪的肾、肝组织切片和PK15细胞无染色反应。单克隆抗体与猪瘟病毒感染的PK15细胞或猪肝、肾小血管内皮细胞中的猪瘟病毒呈现较强的特异性棕色着染,表明该单抗是针对猪瘟病毒的单克隆抗体,对研究猪瘟病毒在宿主细胞中的生命活动和繁殖定位有非常重要的意义。该单抗命名为YNF,培养上清液和腹水的抗体效价分别为1∶80和1∶10 000。抗体蛋白属IgG类,亚类为IgG2/κ。     

Prohibitin 2基因参与猪圆环病毒2型PK-15细胞感染的研究

为探究Prohibitin2(PHB2)在PCV2感染细胞过程中发挥的作用,首先通过间接免疫荧光试验检测PCV2在PK-15细胞中的增殖变化,同时建立PHB2荧光定量PCR检测体系,然后以PCV2已知的宿主细胞互作蛋白gC1qR为对照,检测PCV2感染PK-15细胞后PHB2 mRNA的动态变化,最后鉴定PHB2 siRNA转染PK-15细胞中PCV2 Cap的表达。结果表明,PHB2在正常及PCV2感染的PK-15细胞中均有效表达。随着PCV2感染PK-15细胞,gC1qR转录水平在病毒感染3 h显著降低,感染6 h时升高,随后(12~48 hpi)转录水平下降;而PHB2转录水平在PCV2感染6 h内显著升高,随后(12~48 hpi)mRNA水平有所下降;RNA干扰PHB2对PCV2在PK-15细胞中复制起到显著的抑制作用。上述研究结果表明,PCV2可显著影响PK-15细胞中PHB2转录,而且PHB2对PCV2病毒复制具有调节作用。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与应用

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价分别为1∶6 400 000、1∶640 000和1∶800 000;亚类鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG2a亚类,轻链为κ型;Western-blot结果显示,3株单克隆抗体均能与PCV2Cap蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株单克隆抗体均能与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示,3E5和3E6具有中和活性。利用单克隆抗体3E5建立了检测PCV2抗原的夹心ELISA;它可被用于检测经β-丙内酯灭活的PCV2和杆状病毒表达系统表达的PCV2Cap蛋白。上述研究成果为PCV2感染的诊断和PCV2蛋白功能的研究提供了重要工具和手段。     

两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2,并对其进行了测序与分析。结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97.3%~99.9%,与PCV2 ORF2基因的同源性为67.9%~68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明,PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

与猪圆环病毒2型基因组茎环结构相互作用的宿主细胞蛋白的筛选

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库,将总cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化酵母诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建,以药物筛选阳性克隆;通过酵母菌落PCR得到阳性克隆中的cDNA插入片段,通过序列分析对此予以确认。本试验成功地构建了酵母单杂交文库,筛选出1.01×106个酵母克隆,其中196个为阳性克隆。经PCR产物测序,并通过NCBI Blast法进行序列比对,确定有4种蛋白可与PCV2基因组茎环序列发生作用。本研究从宿主细胞cDNA文库中筛选到4种可与PCV2基因组茎环序列发生作用的蛋白,为下一步阐明这些宿主蛋白对PCV2复制的调节作用奠定了基础。     

猪瘟病毒浙江分离株体外生长特性及其囊膜糖蛋白E2分子的变异分析

为了研究分离于浙江省衢州和杭州的2株猪瘟病毒基因2型流行毒株QZ-07、HZ1-08在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)中的生长特性及其囊膜糖蛋白E2的分子进化特征,采用间接免疫荧光、效价测定和进化分析等分子生物学方法将基因2型流行毒株与基因1型石门株进行了比较。结果表明,石门株在PK-15细胞中的增殖效率明显高于ST细胞;感染PK-15细胞后第48小时,细胞内的效价可达107TCID50/mL,而在ST细胞中的效价只有105.25 TCID50/mL。基因2型毒株在PK-15细胞中的增殖水平明显低于ST细胞,尤其以HZ1-08株更为明显;感染ST细胞后第48小时,细胞内的效价为105 TCID50/mL,而PK-15细胞中的效价只有102.75 TCID50/mL。两基因型毒株E2的核苷酸同源性低于90%,氨基酸同源性约为90%。表明,基因2型毒株的体外生长特性及其E2的分子特性均与基因1型毒株存在差异。     

鸭肿头出血症病毒在鸭胚原代成纤维细胞中增殖特性的研究

将鸭肿头出血症病毒(DSHDV)强毒株经尿囊腔接种10日龄鸭胚,传3代,取第3代尿囊液接种鸭胚成纤维细胞(DEF),传代培养至有细胞病变出现,并对接毒细胞进行TCID50动态检测和透射电镜观察。结果显示,第1代接毒细胞培养至120 h出现变圆、脱落,并形成少量蚀斑,第2代培养至96~120 h,DEF形成大量圆形或椭圆形的典型蚀斑,第3代培养至72~96 h,DEF出现典型蚀斑;此后可稳定适应于DEF,典型细胞病变出现于72~96 h。DSHDV在DEF上的TCID50值随传代次数的增加而增高,由第1代的102.75增加到第10代的106.82,最高毒价出现于96 h,该点是收获病毒的最佳时间。经透射电镜观察,可见DSHDV粒子呈球形或椭圆形,大小为60~75 nm,无囊膜,具有双层衣壳。结果证实,DSHDV强毒株已经适应了DEF,传代后可获得较高的病毒效价。     

牛病毒性腹泻弱毒活疫苗的安全性和免疫保护效果研究

为评价牛病毒性腹泻病毒弱毒株的安全性及其免疫保护效果,将致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)驯化培养,接种MDBK细胞,优化病毒增殖条件,并将其免疫牛,评价其安全性及免疫保护效果。结果显示,优化后的病毒效价可达107.5TCID50/mL。动物试验结果显示,1月龄牛接种该弱毒株后,体温正常,白细胞数量没有下降,无任何临床异常表现。免疫牛用BVDV强毒株进行攻毒;结果表明,免疫保护效果良好。表明该毒株可以作为弱毒活疫苗研究的候选毒株。     

猪圆环病毒2型感染裸鼠及BALB/c小鼠的研究

用猪圆环病毒2型(PCV2)经腹腔注射BALB/c小鼠及裸鼠各15只,每隔2周1次,共感染3次。BALB/c小鼠初次、再次感染后均未出现明显的临床症状,仅有2只小鼠出现病理变化;从血清中可检测到PCV2核酸及其ORF2抗体;同时淋巴细胞增殖反应显著增强,NK和CTL细胞杀伤率显著升高;CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞及CD19+B淋巴细胞数量显著减少。裸鼠也未出现明显的临床症状,从血清中可检测到PCV2核酸,但未检测到PCV2 ORF2抗体;除NK细胞杀伤率显著升高外,其余免疫学指标无显著改变。结果表明,BALB/c小鼠比裸鼠对PCV2易感,各项免疫学指标变化与PCV2感染猪一致,但不表现临床症状,仅个别BALB/c小鼠出现病理变化,说明BALB/c小鼠对PCV2不如猪易感。     

猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的安全性及效力试验

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)弱毒株能在Marc-145细胞上正常增殖,经克隆纯化后测得其毒价为107.41TCID50/mL.克隆株对乳鼠、低日龄乳猪和妊娠母猪具有很高的安全性;3日龄乳猪用10-1、10-2稀释的病毒液接种后,能抵御105.8TCID50/mL的PRRS强毒攻击;后备母猪在接种克隆株病毒后于妊娠85 d用PRRS强毒攻击,结果不发生流产;妊娠母猪接种克隆株病毒原液后,足月产仔时其后代无死产、弱仔、干尸化现象.临床应用PRRS弱毒苗12万头份,证明克隆株弱毒苗在控制仔猪呼吸道症状和母猪繁殖障碍方面安全、有效.     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。     

2008～2009年浙江省猪圆环病毒2型全基因组序列的比较和分析

应用PCR方法对2008～2009年采集的99份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的脾、肺、淋巴结混合组织样本进行猪圆环病毒2型(PCV2)检测,并以组织DNA为模板进行了PCV2的全基因组扩增,克隆后进行了测序。结果显示,2008年与2009年浙江省PCV2的平均阳性率为47.5%,与2004～2006年相比基本持平。随机选取18份阳性病料进行PCV2全基因组测序分析,结果,18个毒株均属于Group1,其中5个毒株(27.8%)属于1A分支,3个毒株(16.7%)属于1B分支,9个毒株(50%)属于1C分支。表明,Group1依然是浙江省PCV2的主导基因型,且1C分支从无到有,并逐渐占据主导地位。     

不同佐剂对猪圆环病毒2型灭活抗原免疫效果的影响

为了筛选到能有效提高猪圆环病毒2型(PCV2)灭活抗原免疫原性的佐剂,将ISA206、ISA15A、GEL、CP934、CP940五种佐剂与PCV2灭活抗原混合,配制疫苗后,进行小鼠免疫试验及猪体攻毒保护性试验。小鼠免疫试验结果显示,ISA206和ISA15A组的ELISA抗体、中和抗体水平和淋巴细胞转化试验刺激指数都显著高于空白对照组(P<0.05),但ISA206组与ISA15A之间无显著差异(P>0.05)。猪体攻毒保护试验结果显示,ISA206组的ELISA抗体水平、中和抗体水平明显高于其他组(包括ISA15A组)(P<0.01),二免后ISA206免疫组淋巴细胞转化试验刺激指数与ISA15A组之间差异不显著(P>0.05),但显著高于其他组(P<0.01)。攻毒后,ISA206组仔猪相对日增重高于其他各组(P<0.01),体内带毒和体外排毒的仔猪数量最少(各2头)、持续时间最短(分别在第11天和第7天消失)。病理切片显微观察显示,攻毒后ISA206组的组织病理变化最为轻微。上述结果说明,佐剂ISA206配制的疫苗免疫效果明显优于其他佐剂疫苗。