伪狂犬病病毒Bartha-K61株TK基因的分离鉴定

提取伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株基因组DNA,用限制性内切酶KpnⅠ充分消化,回收5.9×103b片段(J片段),将其克隆于质粒pUC119 KpnⅠ位点上,获得pBKJ.用一对针对PRV TK基因的特异性引物对重组质粒进行PCR鉴定,证明其中含有PRV TK基因.然后用KpnⅠ、PstⅠ和BamHⅠ等限制性内切酶对其进行酶切分析,确定了克隆片段的物理图谱.进一步研究证实TK基因位于其中的KpnⅠ-BamHⅠ或KpnⅠ-Pst Ⅰ片段中.然后亚克隆此KpnⅠPstⅠ片段,并进行了序列测定.     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及表达

从亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒中提取总RNA,采用反转录聚合酶链反应获得了长度约为700bp的核苷酸片段,大小与预期长度相符。扩增产物经克隆测序,证明其为VP1基因。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX 4T 1,成功构建了重组表达质粒pGEX VP1;利用IPTG诱导,表达出了53ku的目的蛋白条带。Western blotting分析表明,表达产物能与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒抗血清特异性结合。亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP1在大肠埃希氏菌中表达成功。     

表达鹅细小病毒VP3基因的重组腺病毒的构建及其免疫原性分析

为构建表达鹅细小病毒(GPV)VP3基因的重组腺病毒,并检测其对雏鹅的免疫效果,将GPV VP3基因克隆至腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd-VP3;将经PacⅠ酶切线性化的重组穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293AD细胞,得到重组腺病毒rAd-VP3。采用RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光试验鉴定GPV VP3基因在真核细胞中的表达,用rAd-VP3免疫1月龄雏鹅,检测血清抗GPV蛋白抗体水平。结果显示,重组腺病毒rAd-VP3能感染HEK293AD和GEF细胞并表达GPV VP3蛋白,增殖至第6代重组病毒的效价可达108.23 TCID50/0.1mL;rAd-VP3能诱导雏鹅产生抗GPV特异抗体,免疫后第28天血清中抗GPV VP3蛋白抗体仍维持较高水平。结果表明,rAd-VP3具有良好的免疫原性,可作为一种安全有效的病毒活载体疫苗用于鹅细小病毒病的免疫预防。     

马立克氏病病毒gB基因的克隆及重组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒 (MDV) 2 .8kbgB基因 ,并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ酶切位点。然后用PstⅠ /NotⅠ酶切回收 gB片段 ,插入到转移载体 pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ /NotⅠ酶切位点处 ,构建了转移质粒pEFgpt12s gB。将该质粒与鸡痘病毒 (FPV)野毒 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过MXHAT选择培养基进行筛选 ,蚀斑纯化 ,经PCR扩增证实重组病毒中含有 gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别 ,病毒效价分别为 10 -5.43 TCID50 /mL和 10 -6TCID50 /mL ,表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性     

H5N1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中,构建重组转移载体pSY(NA+LacZ),将其转染鸡胚成纤维细胞,经蓝白斑筛选,纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA,用其免疫SPF鸡,检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示,该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白,表达产物的分子质量约为55 ku;用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后,能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明,重组禽痘病毒rFPV-NA具有良好的免疫原性。     

猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3'端对病毒样颗粒形成的影响

以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3'端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析.结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒.通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3'端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3'端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒.     

腔上囊病病毒VP2基因重组腺病毒的构建

采用RT-PCR方法扩增腔上囊病病毒(IBDV)VP2 基因,亚克隆到 pAdlox转移载体,与野生型腺病毒ψ5一起共转染Cre8细胞,将IBDV-VP2基因在5型腺病毒中进行表达。结果,获得了含有腔上囊病病毒 VP2 基因的重组腺病毒 Adv VP2,感染重组腺病毒的细胞经 Western blotting检测,得到了1个约37 ku的VP2多肽,而感染空载体病毒的细胞及对照细胞则无此蛋白条带。证实,成功构建了表达IBDV VP2基因的重组腺病毒。     

山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA复制非必需区的筛选

提取山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA,用HindⅢ酶切,随机克隆到pUC18质粒中,限制性内切酶片段电泳分析和序列测定结果表明,克隆到4个不同大小的HindⅢ片段pUA、pUB、pUC和pUD。随后,将它们和羊痘病毒Pellor(AY077835)株进行了同源性比较,发现核苷酸同源性为90.0%~94.5%,氨基酸同源性为83.0%~91.4%。选取克隆或亚克隆后的单一酶切位点,插入P11P7.5-LacZ报告基因,构建了pUA1、pUB1、pUC1和pUD1共4个重组载体质粒。通过脂质体分别转染山羊痘病毒感染的BHK-21细胞,在X-gal存在条件下经蓝白斑筛选重组病毒,获得1株重组病毒,证明筛选出了1个复制非必需区片段。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA 2.5kb基因片段的分子克隆及其表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内分离株721株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出ApxⅣA基因2.5kb特异片段,将其克隆于pMD18T中,经酶切鉴定筛选重组质粒后进行核苷酸序列测定,并与GenBank中登录的血清1型ApxⅣA(AX002405)基因进行比较,结果显示核苷酸同源性为99.5%。将该片段亚克隆到原核表达载体pGEX6P1的EcoRⅠ/SalⅠ位点,成功地构建了重组表达载体pGEXapxⅣA,并转化大肠埃希氏菌BL21,获得了表达。SDSPAGE检测结果显示,表达的融合蛋白分子质量约为117ku,与预期片段大小相符;Westernblotting分析证实,该融合蛋白具有免疫学活性。     

鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达

采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒(GPV)的检测抗原,利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VP1与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP(1-3),分别转染sf9细胞,得到重组病毒,分别表达出了54 ku的NS2融合蛋白和24 ku的VP(1-3)融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实,表达产物具有特异性;间接免疫荧光试验证实,重组蛋白在细胞中获得了表达。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

云南省红河州山羊流产病原的调查

针对红河州山羊妊娠期流产严重的现象 ,进行了流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、实验室诊断、人工感染试验和治疗试验。结果发现 ,妊娠母山羊流产现象覆盖全州 ,且流产率以每年 11.5 0 %的速度递增 ,弓形虫抗体阳性率为 30 .82 % (12 10 / 392 5 ) ,衣原体抗体阳性率为32 .31% (12 6 8/ 392 5 ) ,其中弓形虫和衣原体双重感染阳性羊占 9.35 % (36 7/ 392 5 ) ,未检出布鲁氏菌抗体阳性羊 ;自流产胎儿肺抹片中发现弓形虫滋养体包囊 ,7份流产胎儿中有 6份分离到衣原体 ;用土霉素及复方新诺明治疗有明显效果 ;人工感染试验能复制出与自然病例相同的病例模型。调查结果表明 ,红河州广泛流行的山羊妊娠期流产的病原是弓形虫、衣原体 ,2种病原单一感染或混合感染是造成流产的主要原因。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

朝鲜的核、导战略态势及其影响

朝鲜实施导弹发射和地下核试验,意在实现核拥有,籍以提高对美战略的筹码。朝鲜开展核战略角逐由来已久,先后展开过以守为攻;“边缘”对应;将计就计;以硬对强四个回合。角逐结果虽不乏战术上的小胜,却丧失了战略上的大胜。此番的导弹试射与地下核试验可视为第五个回合,是朝鲜核、导角逐战略“以攻为守”的转换。朝鲜执意实现核拥有纵有多种原因,却因核、导本身所拥有的“双刃剑”作用,带来于己、于他都不利的负面影响。包括:自食其言,愈加难以取信于国际社会;产生连锁反映,引发新一轮的军备竞赛;挑战核不扩散条约,难免遭到更大封杀;破坏合作气氛,延缓统一进程;置中国于尴尬境地,动摇中朝关系基础。朝鲜的“自行其事”难免遭到国际社会更加严厉的抵制。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。