鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1β亚基单克隆抗体的制备和鉴定

为制备鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1β亚基(PDHB)的单克隆抗体,将鸡毒支原体Rlow株的pdhb基因进行克隆和原核表达。表达产物纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗鸡毒支原体PDHB抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为2D11、3B5和4D9。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024~1∶2 048,小鼠腹水的抗体效价为1∶12 800~1∶25 600。单克隆抗体特异性试验显示,获得的腹水单克隆抗体均能与鸡毒支原体各菌株发生反应,而不与其他禽类病原发生反应。3株单克隆抗体的抗体亚型均为IgG1,轻链均为κ链。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。鸡毒支原体PDHB单克隆抗体的成功制备,为研究丙酮酸脱氢酶的生物学功能和进一步建立检测方法奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白D位点单克隆抗体的制备和鉴定

通过大肠杆菌表达了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的D位点,并以D位点的六聚体作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法进行克隆。结果显示,得到3株能稳定分泌抗TGEV S蛋白D位点单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2C104、5E1012和4B101,其中2C104和5E1012分泌抗体类型是IgM亚类,4B101为IgG1亚类。2C104、5E1012、4B101三株杂交瘤细胞培养上清液的间接ELISA抗体效价分别为1∶128、1∶128、1∶64,腹水效价分别为1∶103、1∶104、1∶4×103。间接免疫荧光鉴定结果表明,3株细胞均能和TGEV发生特异性反应,且在连续传代和冻存后仍能稳定分泌抗体。本研究针对S蛋白D位点制备了单克隆抗体,为传染性胃肠炎的诊断和TGEV与宿主互作机制的研究奠定了基础。     

鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗鸭疫里默氏杆菌(RA)tD15蛋白的单克隆抗体并对其特性进行鉴定,应用纯化复性的重组tD15蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,应用有限稀释法筛选出抗RA tD15重组蛋白的阳性杂交瘤细胞株;采用腹水诱生法制备单克隆抗体腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞以及测定单克隆抗体的特性、效价及其相对亲和力。结果显示,获得2株抗RA tD15蛋白的阳性杂交瘤细胞株,遂被命名为4#、16#,2株细胞株经反复冻存复苏,体外传代仍能稳定分泌抗体;4#单克隆抗体属于IgG1,κ链;16#单克隆抗体属于IgG2b,κ链;4#杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶3 200,腹水效价为1∶12 800,16#杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶6 400,腹水效价为1∶204 800;2株单克隆抗体均能够识别大小约为34ku的蛋白,说明这2株单克隆抗体是特异性识别tD15蛋白的抗体;这2株单克隆抗体能够与鸭疫里默氏杆菌全菌裂解蛋白发生特异性反应,而不与其他鸭源的病原体发生反应;测得它们的亲和常数分别为1.52×109 L/mol和1.00×1010 L/mol。结果表明,这2株单克隆抗体可能识别两种不同的抗原表位。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研究

采用差速离心和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北京地区分离株BJ-4病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,按常规杂交瘤技术制备杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌PRRSV抗体的单克隆杂交瘤细胞株,命名为GE3.经过鉴定,GE3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚类为IgG1;分子质量为161.64 ku;腹水效价为18×104;不与猪瘟病毒(HCV)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应;蛋白质印迹(Westren-blotting)试验结果表明,该株单克隆抗体为针对核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体;腹水与欧洲株(Lv)、美洲株(VR-2332)和北京分离株BJ-1、BJ-2、BJ-5、BJ-6均能发生反应,说明其所针对的位点为NP上的保守位点.     

羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体,应用PCR扩增羊口疮病毒B2L基因并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果显示,获得了4株稳定分泌抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体细胞株,其抗体亚类均为IgG1。Western-blot鉴定结果和间接荧光抗体试验表明,4株单克隆抗体均能特异性识别羊口疮病毒。经鉴定,4株单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶640~1∶1 280,腹水效价为1∶25×211~1∶25×212。染色体计数表明,4株杂交瘤细胞均是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。结果表明,抗羊口疮病毒单克隆抗体的成功制备,为进一步研究羊口疮病毒的生物学特性及羊口疮快速诊断方法的建立奠定了基础。     

抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)VR株CEF适应毒制备抗原,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术以间接ELISA筛选获得1株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞.对制备的细胞上清及腹水进行单克隆抗体特性鉴定,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS-PAGE电泳,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于90-110条,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子质量为142 ku,ELISA测定细胞上清效价为11×104,腹水效价为11×106,与其它病原无交叉反应,抗体分泌稳定.     

鹅细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其对应抗原表位区的分析

为获得抗鹅细小病毒(GPV)VP1蛋白的单克隆抗体,以纯化的VP1蛋白为免疫原,免疫4～6周龄的雌性BALB/c鼠,经4次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,共获得5株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。Western-blot结果表明,这5株杂交瘤细胞分泌的抗体均能特异地与纯化后的GPV-VP1重组蛋白发生反应,单克隆抗体亚型鉴定结果表明,3株单抗为IgG1亚型,1株单抗为IgG2b亚型,1株单抗为IgA亚型,轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析,结果鉴定出3个抗原表位识别区,分别位于VP1的第92～123、92～145和111～145aa。证实,这5株杂交瘤细胞在体外长期培养能稳定地分泌抗GPVVP1的单克隆抗体。     

牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定

为进一步研究牛IFN-γ(BoIFN-γ)单克隆抗体在牛免疫学以及牛疫病诊断中的应用,用原核表达的重组牛IFN-γ(rHis-BoIFN-γ)免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,免疫3次后取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经3～5次亚克隆,最终获得12株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株。Ig亚类鉴定结果显示这12株杂交瘤细胞均为IgG,其中5株为IgG1,3株为IgG2a,4株为IgG2b。这12株杂交瘤细胞在体外具有稳定分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的能力。Western-blot及间接ELISA证明这12株单克隆抗体均可特异性地结合rBoIFN-γ蛋白。间接免疫荧光试验显示,这12株单抗均与真核细胞BHK-21表达的rBoIFN-γ产生荧光反应,证明这些单抗能够与接近天然的BoIFN-γ反应,证实了单抗的特异性。ELISA叠加试验表明,3C2与1H4、1G6与1G4针对不同表位,1A10、1B2、2B9、3C4四株和1C1与1G6、1G4与3C2、1A10与1G8针对相同或相近的表位。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

在MDBK细胞上增殖牛病毒性腹泻病毒(BVDV)HN 1 株,用蔗糖密度梯度离心法纯化后免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞并与NS0 骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,3次有限稀释法克隆,得到4株能稳定分泌抗BVDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株:3A8、3C7、3C11和3E9。经鉴定,3A8、3C7、3E9株为IgG1亚类,3C11株为IgG2a亚类;杂交瘤细胞的平均染色体数目为99 条。3A8、3C7、3E9、3C11 与BCV、BRV均无交叉反应,但3A8、3C7、3E9与HCV、BDV存在交叉反应,而3C11与HCV、BDV无交叉反应,3C11显示出较好的特异性;杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA效价分别为1∶1 000 和1∶200 000,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。这些McAb的获得为BVDV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与应用

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价分别为1∶6 400 000、1∶640 000和1∶800 000;亚类鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG2a亚类,轻链为κ型;Western-blot结果显示,3株单克隆抗体均能与PCV2Cap蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株单克隆抗体均能与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示,3E5和3E6具有中和活性。利用单克隆抗体3E5建立了检测PCV2抗原的夹心ELISA;它可被用于检测经β-丙内酯灭活的PCV2和杆状病毒表达系统表达的PCV2Cap蛋白。上述研究成果为PCV2感染的诊断和PCV2蛋白功能的研究提供了重要工具和手段。     

伪狂犬病病毒gB和gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

采用大肠杆菌表达系统表达获得了伪狂犬病病毒(PRV)超强毒株ZJ01的gB和gE重组蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆和间接ELISA筛选,获得了4株能稳定分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞培养上清的ELISA抗体效价在1∶1 600~1∶6 400之间,腹水抗体效价达1∶4×105;连续培养20代,抗体效价基本一致。抗gB单克隆抗体B1B6和B3D7属于IgG2b,抗gE单克隆抗体E1B11和E5C10属于IgG1,轻链均为κ型。Western-blot和IFA结果显示,4株单克隆抗体均能与PRV流行毒株ZJ01、HZ、SD、NJ、LA发生特异性反应,B1B6和B3D7还能与PRV gE基因缺失疫苗毒株Bartha-K61发生反应,但E1B11和E5C10不能与Bartha-K61发生反应。     

鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯鸭肠炎病毒 (DEV)鸭胚成纤维细胞适应毒 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经间接ELISA筛选 ,有限稀释法 3次克隆 ,获得了 2株稳定分泌DEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1B6和 2G8。经鉴定 ,2株单克隆抗体分别为IgM和IgG1 亚类 ,腹水ELISA效价均达到 1∶1 0 7以上。以 2G8单抗腹水为材料 ,采用间接免疫荧光抗体技术对DEV标准毒感染的鸭胚成纤维细胞进行检测 ,结果表明 ,用该抗体可特异性检出接毒后 6h感染细胞中的DEV ,且感染后 4 8h免疫荧光强度最高 ,该单抗与细胞成分和鸭肝炎病毒无交叉反应。将杂交瘤细胞冻存 3和 6个月 ,复苏后仍能稳定分泌单克隆抗体     

抗弓形虫SAG2蛋白单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

为制备抗弓形虫SAG2蛋白的单克隆抗体(McAb),用纯化的rSAG2蛋白免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选稳定分泌高效价McAb的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单抗。用ELISA方法测定其效价;单克隆抗体类型鉴定试纸条鉴定其类型;Western-blot和IFA试验进行特异性鉴定。结果显示,筛选出2株能稳定分泌抗SAG2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为5E2、2A8。间接ELISA测定其效价分别为1∶256 000、1∶128 000;2株单克隆抗体亚型均为IgG1型,轻链均为κ链;Western-blot与IFA试验表明,这2株McAb均能够特异性识别天然构象的SAG2蛋白,并且进一步说明此蛋白是位于弓形虫膜表面的蛋白。成功获得了具有较高特异性及敏感性的抗SAG2蛋白的单克隆抗体,并能特异性识别天然构象的SAG2蛋白,为弓形虫病免疫诊断及基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

分泌抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立——体外免疫法制备免疫脾细胞

作者用纯化弓形虫速殖子可溶性抗原体外免疫BALB/C小鼠的正常脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ABC—ELISA和IHA筛选和3次克隆化培养后获得了1株分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞(E5)。E5杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经琼脂双扩散免疫试验确定为IgGl亚类抗体。单克隆抗体的抗原吸收试验结果证明E5单克隆抗体为抗弓形虫特异性抗体。E5杂交瘤细胞的染色体数目为92～108,经连续30代传递培养和4个月冻存复苏试验证明其分泌特异性单克隆抗体的性能相当稳定。初步证实E5单克隆抗体针对一种弓形虫的共同抗原成份。     

抗鹅细小病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及对应抗原表位区的分析

以鹅细小病毒非结构蛋白NS1(GPV-NS1)的重组质粒pcDNA3.1-GPV-NS1及纯化的重组蛋白GPV-NS1为抗原,分组免疫4～6周龄的BALB/c鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并研究其部分生物学特性.结果共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株.单克隆抗体亚型鉴定结果显示,2株为IgG2a型,4株为IgM型,轻链均为κ链.用制备的单克隆抗体对分段表达的NS1蛋白进行免疫印迹分析,结果鉴定出3个抗原表位区,分别位于NS1蛋白的第453～514 aa、485～542 aa、533～598 aa区段.证实,6株杂交瘤细胞在体外长期培养能稳定地分泌抗GPV-NS1单克隆抗体.     

滑液支原体二氢硫辛酰胺乙酰转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备滑液支原体(MS)的单克隆抗体,将滑液支原体WVU 1853株全菌免疫的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,在间接ELISA检测的基础上经有限稀释法克隆化,成功筛选出3株分泌抗MS WVU 1853株单克隆抗体的杂交瘤细胞融合株1B3、1E7及4E8。ELISA和Western-blot试验表明,这3株单克隆抗体可特异性地与滑液支原体WVU 1853株的32ku蛋白质结合,而与禽的其他几种常见病原微生物无任何反应。亚类鉴定结果表明,这3株单克隆抗体重链均为IgG1,轻链均为λ型。质谱分析结果表明,所获得的3株单克隆抗体均为抗滑液支原体二氢硫辛酰胺乙酰转移酶单克隆抗体。     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

应用杂交瘤技术获得了1株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞2D6。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,诱生腹水抗体效价达1∶6×104,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)以及禽传染性支气管炎病毒(IBV)抗原之间均无交叉反应;ELISA阻断试验表明,TGEV特异性阳性血清对TGEV-McAb有明显的阻断作用,该McAb所识别的抗原是TGEV所特有的抗原决定基。     

沙丁胺醇单克隆抗体的制备及其鉴定

将沙丁胺醇 (salbutamol)琥珀酰化后 ,应用混合酸酐法与牛血清白蛋白偶联 ,免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术获得了 1株能稳定分泌抗沙丁胺醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该单抗为IgG1亚类。经间接ELISA方法测定 ,其细胞上清抗体效价为 1∶3 .2× 10 6,腹水抗体效价为 1∶6.4× 10 8。该抗体与克仑特罗交叉反应率为 5 0 .0 0 % ,与莱克多巴胺交叉反应率为 0 .3 0 %。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。     

用重组腺病毒免疫方法制备伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体

将表达伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gC基因的重组腺病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,测试了重组腺病毒免疫小鼠制备抗目的蛋白单克隆抗体的效果。ELISA分析表明,BALB/c小鼠接种重组腺病毒后能产生针对gC蛋白的特异性抗体。给BALB/c小鼠用大肠杆菌表达的gC融合蛋白MBP-gC-NC加强免疫后第3 d,取小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行杂交融合,经筛选、克隆,获得了3株稳定分泌抗PRV gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4、1H4和2C8。单抗特性分析结果表明,1B4、2C8属IgG2a亚类,1H4属IgG1亚类;腹水抗体的ELISA效价为1∶2×105~1∶2×106;3株单抗都具有间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western-blotting)反应特性,能够特异地识别PRV gC蛋白。证实重组腺病毒免疫可用于制备目的蛋白单克隆抗体,为制备单抗提供了一种新的方法。