酶联免疫吸附试验诊断环形泰勒虫感染牛的研究

用层析法制备的牛环形泰勒虫（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａａｎｎｕｌａｔａ）抗原用于ＥＬＩＳＡ试验，检测６２头份带虫牛血清，阳性符合率９６．６７％；在疫区检测１５０头份牛血清，阳性率８０．４３％；在瑟氏泰勒虫流行区检测４５４头份牛血清，有交叉反应，阳性率２８．１９％；检测８９头份安全区牛血清阴性符合率１００％。用正常红细胞抗原和环形泰勒虫抗原分别对人工感染和自然感染牛作了特异性试验，结果ＥＬＩＳＡ前者ＯＤ值为阴性，后者ＯＤ值为阳性。２头人工感染牛于接种后１４～２０天测出抗体，３０天达到高峰，然后下降．其中１头牛接种后１２个月ＥＬＳＡ值仍明显高于健康于。环形泰勒虫抗原与双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、大巴贝西虫、边缘边虫、日本血吸虫、伊氏锥虫、肝片吸虫抗血清不发生交叉反应。检测瑟氏泰勒虫血清，有３／４的阳性反应率，证实环形泰勒虫与瑟氏泰勒虫有密切的血清学关系。     

间接荧光抗体诊断牛边缘边虫病的研究

间接荧光抗体试验(IFAT)检测边缘边虫(Anaplasma marginale)感染牛血清快速准确,具有实际应用价值。利用冷藏抗原片进行的IFAT结果表明,该法具有特异性强、敏感性高等特点,人工感染牛符合率为100％;就疫区273份血清的检查,阳性率为35.2％,对安全区86份血清的检查,假阳性占3％。抗体消长实验表明,人工感染牛于第5天即可测出IFA抗体,60～70天达到高峰(1:5120),并维特一段时间,在感染后335天,抗体消失。在本试验中边缘边虫抗原与双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、瑟氏泰勒虫、伊氏锥虫感染牛血清均无交叉反应;与绵羊边虫感染羊血清有很强的交叉反应。     

环形泰勒虫SPAG蛋白的原核表达及反应原性分析

根据GenBank中公布的环形泰勒虫子孢子表面抗原(SPAG)基因序列,结合生物信息学分析,对SPAG蛋白跨膜区和抗原表位进行分析。选取基因片段设计表达引物,从环形泰勒虫不同虫株的SPAG基因的保守区扩增目的片段,并构建SPAG-pET-30a重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达系统中进行表达,并对SPAG重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,获得的SPAG基因片段长度为882 bp,重组蛋白分子质量约为42 ku。反应原性分析显示,该重组蛋白可与环形泰勒虫阳性血清发生特异性反应,与中华泰勒虫、瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的阳性血清无交叉反应。本研究结果表明,SPAG蛋白有较好的反应原性和种特异性,可作为检测环形泰勒虫的候选抗原建立相应血清学诊断方法。     

牛隐孢子虫病的研究——免疫琼脂扩散试验

采用蔗糖不同密度梯度离心分离牛隐孢子虫卵囊,超声波加冻融裂解,制备可溶性和颗粒抗原,与参考阳性血清和免疫家兔血清呈阳性反应;与参考阴性血清和从非疫区采集的30份犊牛血清呈阴性反应;对牛焦虫病血清、球虫病血清、轮状病毒性肠炎血清均无交叉反应;对被检测的96份自然感染隐孢子虫犊牛血清阳性检出率为81.25％;对42份实验感染隐孢子虫雏鸡血清阳性检出率为78.57％。初步证明用免疫琼脂扩散试验诊断牛隐孢子虫病是可行的。     

牛巴贝斯虫病ELISA诊断方法的建立

以BORCT蛋白为包被抗原,优化最佳反应条件,确定阈值并测定其交叉反应,建立了一种特异性检测牛巴贝斯虫抗体的间接ELISA方法。利用该方法测定了试验感染的2头牛的抗体动态曲线,并对我国四川、甘肃、新疆3个省(自治区)的314份牛血清样品进行了检测。结果显示,经MedCalc 12.7.3.0软件分析86份阴性血清和69份阳性血清的检测结果,确定29.6%抗体比率为该方法的阳性阈值,对应的敏感性和特异性分别为94.2%和96.5%,并且与其他巴贝斯虫、泰勒虫和无浆体阳性血清均无交叉反应。对试验感染动物的检测结果显示,感染后的第6天出现特异性抗体,第12天达到最高值,一直持续到第270天。野外样品检测结果显示,3个省份均有牛巴贝斯虫的分布,平均阳性率为46.82%。     

金华市部分乡镇奶牛巴贝斯虫病的流行病学调查

为有效防控金华市奶牛巴贝斯虫病,根据牛巴贝斯虫病间接ELISA检测方法,以纯化的重组蛋白GST-MSA-2c作为抗原,对2009-2011年金华市7个乡镇的奶牛巴贝斯虫病进行了流行病学调查。结果显示,金华存在奶牛巴贝斯虫病,在2009年采集的296份牛血清样品中,阳性血清11份,感染率为3.72%;在2010年的306份牛血清样品中检出阳性血清14份,感染率为4.58%;在2011年的307份牛血清中检出阳性血清11份,感染率为3.58%。结果提示,金华市奶牛巴贝斯虫感染率以农户散养最高,建立集约化养殖制度和家畜原虫病综合防疫措施迫在眉睫。     

微量补体结合试验诊断边虫感染牛的研究

利用边缘边虫DS—1株接种除脾易感牛,制备出补体结合试验诊断抗原,并建立了边虫感染牛总量为0.2ml的微量补反诊断法。所制备的抗原具有良好的特异性和敏感性,对实验室条件下人工感染牛的补反检查,符合率为100％;自然条件下感染牛补反检查的符合率为92.3％;安全区牛无假阳性反应。人工感染牛于第10天可测出补反抗体,30～40天抗体滴度达到高峰,60天后开始下降。边虫补反抗原与瑟氏泰勒虫、双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、伊氏锥虫、肝片吸虫、日本裂体吸虫感染牛血清无交叉反应,与正常红细胞免疫牛血清反应为阴性结果。     

补体结合试验诊断边虫感染牛的研究

利用边缘边虫DS-1株接种除脾易感牛,制备出补反诊断抗原。所制备的抗原具有良好的特异性和敏感性,并建立了总量为0.6ml的补反诊断方法。对试验条件下人工感染牛的补反检出率为100％,安全区无假阳性反应。人工感染牛第5天出现补反抗体,感染后20～50天血清抗体达到高峰,以后开始下降,7个月后补反抗体消失。所制备的补反抗原与双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、大巴贝西虫,环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、伊氏锥虫和日本血吸虫等几种血液寄生虫抗血清之间没有交叉反应。抗原保存期达一年以上。所制备的抗原达到了国外同类产品的水平。     

中华泰勒虫MPSP基因的原核表达及反应原性分析

用生物信息学方法,对中华泰勒虫的梨浆虫主要表面蛋白(major piroplasm surface proteins,MPSP)基因的核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列进行了分析,并对该蛋白的抗原表位、信号肽以及跨膜区进行了预测。设计特异性引物,对中华泰勒虫MPSP基因进行了克隆和原核表达,并对融合蛋白的反应原性进行了分析。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白的分子质量约为38ku,分布于上清中。Western-blot试验表明,融合蛋白仅与抗His标签蛋白的单克隆抗体、中华泰勒虫阳性血清、瑟氏泰勒虫阳性血清、环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与其他泰勒虫、巴贝斯虫和绵羊无形体阳性血清不发生反应。这些结果表明,中华泰勒虫MPSP可作为ELISA诊断方法的候选抗原。     

牛环形泰勒焦虫补反抗体测定

据资料报道,补体结合反应(CF)是动物和人感染原虫后出现的一种比较特异性的血清学反应。 ( 1966)用环形泰勒焦虫红细胞型虫体作抗原。检测了实验感染环形泰勒焦虫牛的补反抗体,对补反阳性牛进行攻蜱试验,结果表明阳性牛具有对该病的免疫力。P.Hooshmand-Rad等(1971)利用环形泰勒焦虫组织培养物作抗原成功地测定了牛体注苗后血液中的补反抗体。关于这方面的资料国内尚未见报道。本实验以人工培养     

牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法的建立

为建立一种适用于基层兽医实验室特异、敏感、快速检测牛巴贝斯虫感染的方法,以牛巴贝斯虫球状体蛋白4(SBP4)基因为靶基因设计引物,建立检测牛巴贝斯虫的巢式PCR方法。结果表明,该方法可特异性地检测牛巴贝斯虫感染,与14种动物梨形虫无交叉反应。该方法能够检测到1 copy的SBP4基因,其敏感性分别是对应的内、外引物普通PCR的10倍和1 000倍。应用该巢式PCR方法,对田间随机采集的136份野外样品进行检测,检出阳性样品9份,显著高于AbouLaila等报道的方法(5份)。这些数据表明,建立的巢式PCR方法可用于基层兽医实验室敏感、准确地检测牛巴贝斯虫感染。     

双芽巴贝斯虫RAP-1C基因的克隆表达及重组蛋白反应原性的研究

拟通过对双芽巴贝斯虫棒状体相关蛋白1(rhoptry-associated protein-1,RAP-1)羧基端进行研究,以期了解该蛋白的一些免疫学特性。利用生物信息学软件,对RAP-1进行抗原表位预测,并与其他重要的巴贝斯虫和泰勒虫相应基因序列进行比对,以筛选出抗原性和特异性均良好的基因片段;针对筛选出的基因片段设计引物,对该基因进行克隆和原核表达,最后利用Western-blot对重组蛋白的反应原性和特异性进行分析。结果显示,融合目的蛋白含His标签,分子质量为26ku左右,该蛋白只与双芽巴贝斯虫阳性血清发生特异性反应,与其他主要巴贝斯虫、泰勒虫的阳性血清无交叉反应。结果表明,表达的PAP-1蛋白可作为ELISA诊断方法的候选抗原,为建立一种双芽巴贝斯虫病特异性的免疫学诊断方法奠定了基础。     

卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种检测感染牛的卵形巴贝斯虫的敏感、快速方法,本研究根据GenBank中登录的卵形巴贝斯虫18S rRNA保守区设计1对特异引物,通过优化反应条件,建立了检测卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异地检测出卵形巴贝斯虫DNA,对瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫DNA的检测均为阴性;该方法的灵敏度可达1.26 copies/μL,比普通PCR灵敏度高100倍。组内及组间重复试验的变异系数均小于3%。对60份临床牛血液DNA样本进行检测,荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为41.67%和33.33%。结果表明,本试验建立的荧光定量PCR方法可用于对卵形巴贝斯虫定量分析和卵形巴贝斯虫病的分子流行病学调查。     

边缘无浆体MSP5重组抗原间接ELISA检测方法的建立

将边缘无浆体MSP5基因在大肠杆菌DH5α中表达,获得45 ku的融合蛋白.Western-blot检测证实该表达蛋白具有良好的生物学活性.以纯化的融合蛋白为抗原,建立了边缘无浆体MSP5的间接ELISA检测方法.该方法对边缘无浆体阴性、阳性血清(各100份)的阳性检出率和阴性符合率分别为100%和98%,与双芽巴贝虫、大巴贝虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、衣原体、血吸虫和羊肝片吸虫的阳性血清无交叉反应,与羊无浆体阳性血清有交叉反应.结果表明,建立的间接EHSA方法具有良好的特异性和敏感性.     

牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原,建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶1600,血清稀释度为1∶60,抗原和血清、血清和二抗均在37℃反应30 min,底物在37℃显色15 min,D655 nm阴性、阳性临界值为0.5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验,表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测,结果显示,阳性血清的符合率为27.8%,阴性血清的符合率为91.7%。     

吕氏泰勒虫TlSP无跨膜区重组蛋白的表达及反应原性分析

提取吕氏泰勒虫裂殖子的总RNA,采用RT-PCR方法扩增其表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein)基因的cDNA片段,结合生物信息学方法,对TlSP蛋白抗原表位和跨膜区进行预测,设计表达引物,分别扩增得到TlSP全长及逐一去除跨膜区的4个片段,并将其分别克隆至pET-30a原核表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达,并对融合蛋白的反应原性进行分析。结果表明,TlSP融合蛋白的N端具有较好的抗原性,而在C端存在3个跨膜区:185~207 aa、228~250 aa和255~277 aa;SDS-PAGE结果表明,只有去除全部跨膜区的重组载体可成功表达。Western-blot分析表明,TlSP融合蛋白能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、羊无浆体阳性血清无交叉反应。本研究为今后TlSP候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

莱姆病间接ELISA诊断方法的建立及应用

使用培养的狭义伯氏疏螺旋体B31菌株制备可溶性抗原,建立羊莱姆病血清抗体的间接ELISA诊断方法。应用伯氏疏螺旋体阴性、阳性血清评价该方法的特异性和敏感性。根据所建立的方法对从甘肃省甘南地区采集的450份羊血清进行检测。结果显示,该方法对羊莱姆病的阳性检出率和阴性符合率分别为90.1%和90.0%,与羊霉形体、布鲁氏菌、弓形虫以及羊无浆体、巴贝斯虫、泰勒虫等常见蜱传播病原的阳性血清之间没有交叉反应。甘肃省甘南地区夏河县、临潭县和卓尼县羊莱姆病的感染率分别为3.3%、6.1%和4.1%,甘南地区的平均感染率为5.1%。结果表明,本研究所建立的方法能够用于羊莱姆病的血清学诊断,甘南地区可能存在莱姆病的自然疫源地。     

牛羊边虫和焦虫的冷冻保存试验

为便于人工感染和制作诊断抗原,笔者对牛的大巴贝西虫(Babesia major)、双芽巴贝西虫(B.bjgemina)、环形泰勒焦虫(Thcileria annulata)、环形泰勒裂殖体(Schizont)、牛边缘边虫(Anaplasma mairginale)和绵羊边虫(A.ovis)进行了超低温冷藏试验,获得了满意的结果     

羧化胶乳凝集试验检测边缘无形体血清抗体的研究

利用边缘无形体可溶性抗原 ,以化学交联的方式致敏羧化胶乳制成胶乳抗原 ,成功地建立了一种检测牛边缘无形体血清抗体的胶乳凝集试验 (LAT)诊断方法。用制备的胶乳抗原分别检测瑟氏泰勒虫、双芽巴贝虫、衣原体、附红细胞体阳性血清 ,结果均为阴性 ;与边缘无形体标准阳性血清、免疫牛血清、流行区血清样品均呈明显的凝集反应。研究结果表明 ,LAT方法具有操作简单、快速、敏感性高、特异性强、成本低廉等优点 ,是一种特别适合于基层现场检测边缘无形体血清抗体的新方法。     

我国牛蜱传性血液原虫的虫种调查和分布特征的研究

利用病原检查法对我国２６个省（区）的３１８４头牛进行了牛蜱传性血液原虫调查，并研究了不同生态地区虫种的分布特征。调查共发现双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、大巴贝西虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、突变泰勒虫和边缘边虫７种病原。双芽巴贝西虫分布于云南、贵州、四川等省，感染率为０．９７％～１．５％，媒介蜱为微小牛蜱和镰形扇头蜱。牛巴贝西虫分布于云南、贵州、湖南、湖北等省，感染率为２．３８％～５６．６６％，媒介蜱为微小牛蜱和镰形扇头蜱。大巴贝西虫分布于河南、甘肃、辽宁、新疆等省（区），感染率为１６．６５％～４０％，媒介蜱为长角血蜱和刻点血蜱。环形泰勒虫分布于宁夏、新疆、内蒙、甘肃等省（区），感染率为１７．２４％～３５．３０％，媒介蜱为残缘璃眼蜱。瑟氏秦勒虫分布于云南、贵州、广东、广西等省（区），感染率为３４．６７％～１００％，媒介蜱为长角血蜱。突变泰勒虫分布于贵州、新疆、西藏等省（区），感染率为４５％～５５％，媒介蜱为刻点血蜱。边缘边虫分布于云南、贵州、湖南、湖北等省，感染率为２０％～７９．３１％，媒介蜱为微小牛蜱和镰形扇头蜱。