A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及其产物的生物学活性鉴定

根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列,设计合成了1对特异性引物,以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板,利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因(1 035 bp),将其克隆到pET-32a( )载体上,构建了原核表达载体pET-HA,表达并纯化了重组蛋白,通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示,表达并纯化的HpgHA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合,并且可以凝集鸡红细胞。表明,成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体,并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg-HA融合蛋白。     

野生鸡枞菌多糖的提取及其免疫活性分析

采用水提醇沉法获得鸡枞菌多糖,并对其总糖含量进行了测定;研究了不同剂量的鸡枞菌多糖对正常小鼠的免疫器官指数、血清溶血素水平、腹腔巨噬细胞吞噬功能及脾淋巴细胞增殖等免疫指标的影响。结果:鸡枞菌多糖得率为6.27%,总糖含量为94%;根据体重腹腔注射20mg/kg的鸡枞菌多糖可明显提高正常小鼠的溶血素水平(P<0.01)、脾指数(P<0.01)、胸腺指数(P<0.05)和巨噬细胞吞噬功能(P<0.01);体外试验中,与空白对照组相比,25μg/mL的鸡枞菌多糖可促进体外脾淋巴细胞增殖(P<0.05),12.5μg/mL鸡枞菌多糖对ConA或LPS引起的脾淋巴细胞增殖均有显著的协同作用(P<0.01)。结果表明,鸡枞菌多糖能显著增强小鼠的体液免疫和细胞免疫功能,有望成为一种新的天然免疫增强剂。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

鸡大肠埃希氏菌的药物敏感性测定

鸡大肠杆菌病是由致病性大肠埃希氏菌 (Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ)引起鸡的一种细菌性疾病 ,近年已成为养鸡业主要疾病之一。目前对该病主要是利用抗菌药物进行预防和发病时的治疗 ,由于大肠埃希氏菌血清型繁多、且复杂 ,同时各地区血清型存在较大差异 ,给该病的防治带来很大困难。本试验对分离的 17株大肠埃希氏菌用氟哌酸等 11种药物进行药敏试验 ,旨在为大肠杆菌病的临床治疗提供用药参考。1　材料与方法1.1　试验用菌株　 17株大肠埃希氏菌均从东北地区发病鸡场分离获得 ,并经生化试验鉴定 ,编号为 1— 17号。1.2　培养基　营养琼…     

人和畜禽的空肠弯杆菌分离培养及带菌状况调查

对195例不同年龄腹泻病人的粪样及656只健康和腹泻畜禽的直肠和泄殖腔拭子进行空肠弯杆菌培养,总检出率为26.1%(222/851).人和畜禽的带菌率分别为健康蛋用鸡为61.0%(61/100),腹泻后备蛋用鸡为53.3%(40/75),健康后备蛋用鸡为22.0%(11/50),腹泻仔猪为88.0%(88/100),健康羔羊为5.7%(6/106),牦牛犊为12.4%(15/121)和0(0/104)腹泻病人为0.5%(1/195).蛋用鸡各组间的带菌率差异极显著(P＜0.01),腹泻后备蛋用鸡的带菌率明显高于健康后备蛋用鸡(P＜0.01),显示后备蛋用鸡腹泻与该菌感染相关.腹泻仔猪的带菌率很高,也提示该菌感染与仔猪腹泻存在一定关系.噻孢霉素对空肠弯杆菌检出率的影响和抗生素药敏性试验结果表明,噻孢霉素不能替代头孢霉素Ⅰ,而头孢哌酮钠(头孢必)可取代Camp-BAP琼脂中的头孢霉素Ⅰ.在100mL/LCO2气体环境中微需氧培养比烛缸内培养空肠弯杆菌检出率高13.0%,显示分离该菌以100mL/L CO2法明显优于烛缸法(P＜0.01).     

大肠埃希氏菌和沙门菌氨基糖苷耐药基因PCR检测方法的建立

采用平板稀释法,选用氨基糖苷类药物链霉素、庆大霉素、卡那霉素和新霉素对22 株猪、鸡大肠埃希氏菌和30株猪、鸡沙门菌进行了药敏试验。结果显示,在4种药物中大肠埃希氏菌对卡那霉素的耐药率最高,达81.8%,而沙门菌则对链霉素的耐药率最高,达60%,两类细菌都对新霉素的耐药率最低。设计了5对引物,对耐药基因aph(3′) Ⅱ、aadA1、aadA2、aadB和aac(3) Ⅰa进行了扩增,获得的基因片段与预期的大小一致;序列分析表明,扩增产物与GenBank中的相应序列有很高的同源性(>99.8%)。采用建立的PCR技术,对22株猪、鸡大肠埃希氏菌和30 株猪、鸡沙门菌的耐药基因进行了检测,证实耐药基因普遍存在,在大肠埃希氏菌中aadA1 基因的检出率最高(12/22),在沙门菌中aph(3′) Ⅱ基因的检出率最高(18/30),在所有的菌株中都未能检测出aac(3) Ⅰa基因。     

鸡PrP基因真核表达载体的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达

为构建鸡PrP基因的真核表达载体,并通过毕赤酵母表达系统获得鸡朊蛋白(ChPrP),根据毕赤酵母GS115的密码子偏好性、G+C含量等特点对目的基因PrP(25~248)进行密码子优化与基因合成,同时以特异性引物扩增获得天然未经密码子优化的目的片段,之后将两种目的片段分别连接于pPIC9K表达载体并转化至毕赤酵母GS115中,经PCR,选择培养基MM、MD方法鉴定表型后以甲醇进行诱导获得目的蛋白,最后以SDS-PAGE检测蛋白表达。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,成功构建了真核表达重组载体pPIC9K-PrP(25~248),并在毕赤酵母GS115中获得鸡朊蛋白,其与未经密码子优化的目的蛋白相比,具有更高的表达量。本研究通过毕赤酵母表达系统成功获得了鸡朊蛋白,为后续研究奠定了基础,也通过密码子优化前后蛋白表达量比对,再一次证实毕赤酵母具有较高的密码子偏好性。     

副鸡嗜血杆菌在鸡胚中的生长试验

副鸡嗜血杆菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｇｌｉｎａｒｕｍ）是鸡传染性鼻炎（ＩＣ）的病原菌，引起急性呼吸道病，以鼻道和窦产浆液性到粘液性分泌物、面部水肿和结膜炎为最明显的特征。可导致产蛋率及孵化率下降、淘汰率增加，从而造成严重的经济损失。该菌对培养基...     

鸡鲍氏志贺菌与痢疾志贺菌鸡白痢沙门菌及肠致病性大肠杆菌RAPD鉴别方法的建立

利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对鸡鲍氏志贺菌、鸡白痢沙门菌、肠致病性大肠杆菌和痢疾志贺菌的基因组DNA进行了研究,在此基础上分析了鸡鲍氏志贺菌与其他6个菌株的亲缘关系.结果显示,有4条随机引物的扩增多态性良好,共扩增出了64个DNA片段,其中4种菌共有的谱带有3条,而显示多态性的片段有61条,占95.3%.引物P2的扩增图谱不能将志贺菌和大肠杆菌鉴别开,但可将这2种菌与沙门菌鉴别出来;引物P6的扩增图谱清晰且3种菌间有明显差异,可用于上述3种细菌的鉴别.不同细菌间的遗传距离为0.128～0.790,根据遗传距离可将鸡鲍氏志贺菌等7个菌株分为3个聚类群,鸡鲍氏志贺菌分离株位于人痢疾志贺菌类群中,可能是人志贺菌的一个新的亚种.     

鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为研究sifA基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的sifA基因缺失株S06004ΔsifA,同时构建该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA),并对该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性进行了研究。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了sifA基因缺失株S06004ΔsifA和该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA);生物学特性研究结果显示,sifA基因的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,但其对3日龄雏鸡的LD50升高了39.3倍。本研究获得的减毒鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株S06004ΔsifA为进一步研究鸡白痢沙门菌sifA基因的功能奠定了基础。     

四川省2009-2014年鸡源沙门菌耐药性变迁的调查

为掌握四川省近几年鸡源沙门菌的耐药性变迁情况,本研究于2009-2014年间采集了四川省主要肉鸡养殖场的泄殖腔样品5 445份,分离鉴定获得沙门菌154株,总分离率为2.83%,占主导的血清型为肠炎沙门菌(71.9%)。采用微量肉汤稀释法测定分离菌株对13种抗菌药物的敏感性。药敏试验结果显示,沙门菌对氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸的耐药率最高,分别为83.8%和79.9%,对除多黏菌素E以外的其他10种药物的耐药率大于40%,对多黏菌素E相对敏感。分析了鸡源沙门菌对不同抗菌药物的耐药性随年份的变迁情况;结果显示,2009-2014年鸡源沙门菌对头孢噻呋、庆大霉素、四环素、多西环素、氟苯尼考、复方新诺明、恩诺沙星、氧氟沙星和多黏菌素E这9种药物的耐药率呈上升趋势。6年间多重耐药菌株的比例维持在较高水平(60%),且四重以下耐药菌株的比例逐年下降,而十一重以上耐药菌株的比例呈上升趋势,某些多重耐药谱在多个年份中都有检出。研究结果表明,四川省鸡源沙门菌的耐药情况十分严重,亟须加强养禽业抗菌药物的合理应用以控制耐药性的发展。     

鸡肠道正常菌群的调查

国内对鸡肠道菌群的研究,多侧重于需氧菌及弯曲杆菌。本实验中,通过对九类细菌的检查,以了解鸡后肠道正常菌群的一些情况。 材料与方法 (一)标本采取 1983年7～8月,以棉拭法采取鸡新鲜粪便,置无菌试管中,在30分钟内送到实验室检查。鸡为80日龄肉用鸡。又从新宰的3月龄肉用鸡、摘取盲肠,对内容物进行检查。共取粪便标本13份、盲肠内容物标本6份。 (二)培养基 见表1。     

兔鼠伤寒沙门菌性流产的诊断

沙门菌对实验动物如豚鼠、小鼠、鸡等均易自然感染 ,兔则具有较强的抵抗力。感染沙门菌的实验动物主要以消化道疾病为特征 ,表现为急性下痢 ,而引起兔生殖道感染发生流产的现象在临床上则很少见。深圳市某实验兔场暴发了以流产为主要特征的传染病 ,对此进行了诊断试验。1　材料与方法1.1　培养基　沙门 志贺琼脂培养基、血琼脂培养基、三糖铁培养基、营养琼脂培养基和生化试管均由杭州军区后勤研究所生产。1.2　诊断血清　伤寒Vi诊断血清、0～ 9诊断血清和H～d诊断血清由本所检定处惠赠。1.3　病理剖检观察　按常规方法进行。1.4　组织病…     

动物枝原体疫苗

(一)鸡败血枝原体疫苗 1957年Domermuth将在培养基上或用鸡胚培养的活菌,给雏鸡进行肌肉或皮下接种后,经过4～9周,在后胸气囊内重复感染时,抑制了病灶的形成,标志着已经建立了免疫。其保护率由于感染菌量不同而异,但平均在36.2％,据说增加了免疫次数也未能使保护率提高。McMartin等曾试验给4周龄的鸡鼻腔滴入活菌液,或于腹部气囊直接注射感染,尔后检查气囊的病变或分离枝原体。免疫菌数在10~3菌落形成单位或更多,     

云南省楚雄彝族自治州鸡主要传染病的调查

对采自云南省楚雄彝族自治州楚雄、双柏、姚安、元谋4县(市)的387份鸡血清进行新城疫(ND)、禽霍乱(FC)、鸡白痢(SP)、鸡马立克氏病(MD)、鸡痘(FP)、鸡腺病毒病(CELD)、鸡白血病(ALD)、鸡传染性支气管炎(IB)、鸡传染性喉气管炎(ILT)、鸡传染性鼻炎(IC)、禽脑脊髓炎(AE)共11种病的血清学调查,查出除ALD外的10种病,其阳性率分别为37.21%、9.83%、10.34%、29.97%、35.66%、17.77%、9.30%、7.75%、3.88%和6.46%,其中CELD、IB、ILT、IC和AE5种病为当地首次检出;另对全州鸡病情况进行了历史、现状调查.调查结果显示,当地鸡的主要传染病是ND、FC、SP、MD和FP.     

鸡空肠弯曲菌肠炎的病理形态学观察

弯曲菌是引起人类腹泻的重要病原菌,约占各类腹泻的95％,为空肠弯曲菌所致。1981年英国报道,从腹泻病例分离9500株空肠弯曲菌,超过痢疾分离数。我市1984年几个医疗单位统计,从380例腹泻患儿中分离出空肠弯曲菌22株。现已证明本菌可在多种动物肠腔内存在,包括禽类、家畜中牛、狗、马、羊、猪、兔。Richardson(1979)在南非调查鸡空肠弯曲菌检出率为86.7％,并证实人的本病感染鸡是传染来源。国内外的研究结果均表明,弯曲菌肠炎系人畜共患的一种传染病。本试验对鸡空肠弯曲菌肠炎的病变进行了观察。 (一)材料和方法 选自然感染患有腹泻症状的鸡群病鸡41只,均在300日龄左右,剖杀     

奶牛粪便中空肠弯杆菌的检测

空肠弯杆菌属于胚胎弯杆菌空肠亚种。关于从猪、鸡(腹泻患者)等粪便中分离出该菌的报道较多,但目前尚未见到从奶牛粪便中分离出该菌的报告。为了解空肠弯杆菌在奶牛体内的带菌情况,作者采集133头奶牛粪便,进行了细菌学调查。 (一)材料与方法 1.样品来源:在长春市及农安县的两个牧场,用无菌棉拭子从奶牛肛门直接采样133份。 2.培养基:①分离培养基:上海市卫生防疫站生产的空肠弯杆菌选择性琼脂为基础,每100ml加5～10％脱纤维羊血,50％卵黄盐水10ml;每100ml上述培养基中加入多粘菌素B250μg、万古霉素1.5mg、磺胺增效剂0.5rug,摇匀后倾注平板。②所用其他培养基均为自     

Metalnikowin类抗菌肽MLP的设计及其抗菌活性的测定

为设计新型Metalnikowin类抗菌肽并评价其抗菌活性,依据抗菌肽Metalnikowin的作用机理和氨基酸组成,通过人工方法设计合成Metalnikowin类抗菌肽(Metalnikowin-like antibacterial peptide,MLP)并测定其体外和体内抗菌活性。体外抑菌试验结果显示,抗菌肽MLP对鸡致病性大肠杆菌O 1、猪致病性大肠杆菌K 99(A TCC39302)、鸡白痢沙门菌(ATCC10398)、猪霍乱沙门菌(ATCC13312)、禽多杀性巴氏杆菌(CVCC474)和金黄色葡萄球菌(ATCC29213)均具有很好的抑菌活性,其对这6种细菌的最小抑菌浓度分别为1.56、6.25、3.12、6.25、1.56和12.5 g/m L。酸稳定性试验结果显示,抗菌肽MLP在p H值为5~6时活性最高。热稳定性试验结果显示,抗菌肽MLP 100℃加热40 min后仍具有抑菌活性。在对雏鸡感染鸡大肠杆菌和小鼠感染金黄色葡萄球菌的体内疗效试验中,抗菌肽MLP显示了较好的治疗效果。本研究为临床上设计有效的Metalnikowin类抗菌肽提供了参考数据。     

红茂草生物碱抑菌活性的测定

用醇提法提取红茂草生物碱,经石英色谱柱层析分离、结晶后测定了红茂草生物碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、粪肠球菌的体外最小抑菌浓度(MIC)、抑菌率和半数抑菌浓度(IC50)。结果显示,红茂草生物碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、粪肠球菌的MIC分别是0.22、0.18、0.18、0.30mg/mL;对这4种供试菌的IC50分别是0.180 7、0.140 70、.140 70、.260 5 mg/mL。表明,红茂草生物碱对这4种细菌具有明显的抑制作用。     

厚垣普可尼亚菌胞外蛋白酶的诱导及发酵液生化性质的研究

为探讨不同培养基对厚垣普可尼亚菌胞外蛋白质的诱导效果及相应发酵液的生化性质,以更好地利用该菌对家畜寄生性线虫进行生物防治,在本实验室前期研究的基础上,设计使用3种常用真菌液体培养基对厚垣普可尼亚菌进行发酵培养,并检测发酵液的蛋白质质量浓度、蛋白酶活性,磷酸酶活性及杀虫效力等,筛选出适合该菌液体培养的最佳培养基。结果表明,在3组培养基中,LMZ培养基组的蛋白质种类最丰富,蛋白质质量浓度(2 320 mg/L±10.00 mg/L)、蛋白酶活性(2.95 U/m L±0.23 U/m L)与磷酸酶活性[1.546 U/100 m L±0.035 U/100 m L(酸性磷酸酶)和0.516 U/100 m L±0.069 U/100 m L(碱性磷酸酶)]都较高,对线虫的杀虫率也是3种培养基中最高的,可达60%,与其他各组间差异极显著(P0.01)。因此从生物防治的角度,在试验的3种培养基中,以LMZ液体培养基为最佳选择。这一发现可为今后对厚垣普可尼亚菌液体发酵培养、杀虫物质的产生以及作用机制进行深入探究提供重要基础资料。