过氧化氢酶-氯霉素偶联物的合成及其结合比的测定

利用混合酸酐法合成了氯霉素琥珀酸酯衍生物．再用碳二亚胺将该衍生物与过氧化氢酶偶联,用紫外分光光度法测定已纯化的偶联物中氯霉素与过氧化氢酶的结合比。结果,偶联物中氯霉素与过氧化氢酶的结合比达到30．67:1,偶联物中过氧化氢酶的活性损失约30％。结果表明,该偶联物可作为竞争性ELISA法或免疫传感器法测试氯霉素时所需的酶标抗原。     

免疫组织化学染色法检测旋毛虫病的研究——亲合素-生物素-过氧化物酶复合物染色法

本文应用国产BAS试剂,首次建立了检测实验猪旋毛虫病的亲合素—生物素—过氧化物酶复合物(ABC)染色法。本法与常规间接免疫过氧化物酶(IIP)染色法相比,敏感性强、特异性高、稳定可靠,其血清滴度比IIP法高2.24倍;与IIP法相比,可提前检出抗旋毛虫抗体;该法有助于低抗体水平旋毛虫病猪的诊断。     

不孕症乳牛透明带抗体的检测及治疗

高等动物的透明带是被覆于卵细胞的糖蛋白，含有多种抗原性物质。透明带抗体可以使动物发生长期不育。据报道，人的透明带抗体与不孕症相关，但有关乳牛透明带抗体与不孕症关系的研究报道较少。为此，我们用生物素亲合素酶联免疫吸附法（ＢＡＥＬＩＳＡ）检测了乳牛透...     

用生物素标记核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究

将纯化的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)全基因组用缺口翻译方法把生物素—尿苷三磷酸(Biotin-dUTP)掺入双链IBRV—DNA上作为探针,与点在硝酸纤维膜上的样品进行打点杂交,然后在链霉亲合素—碱性磷酸酶中孵育,用氮蓝四唑和5—溴—4—氯—3—吲哚磷酸作用,阳性反应呈现紫色斑点。通过检测样品中IBRV—DNA同源序列,以确定是否存在IBRV。结果表明,应用生物素核酸探针可检出10pg的IBRV—DNA,具有灵敏、快速、无放射性污染、探针保存时间长等优点,为IBRV临床检测提供了一个有力的手段。     

应用ABC-ELISA诊断实验感染猪旋毛虫病的研究

生物素—亲和素系统(Biotin—Avidin System BAS)是近年来建立的一种新型生物放大系统,它具有高灵敏度,高特异性和高度的稳定性。适用于微量抗体和抗原的检测。本文采用生物素—亲和素与酶联免疫吸附试验相结合的免疫放大作用,将ABC—ELISA技术引入猪旋毛虫病检测,对57头实验感染旋毛虫病猪血清特异抗体及抗体出现的时间进行了检测,其结果如下。     

ELISA诊断猪旋毛虫病条件的研究

七十年代酶标技术广泛用于人、畜寄生虫病诊断。1976年Ruitenbers等用旋毛虫幼虫制备的粗抗原,以酶标技术生前检测猪旋毛虫(人工感染)病,获得比荧光抗体技术测得更为满意的结果。本文用酶标间接法(ELISA)。以自己研制的碱性磷酸酶(Alkaline Phosphrase、AKP)标记兔抗猪IgG,磷酸苯二钠为底物,对旋毛虫病猪和阴性猪进行检测,同时对抗原、抗体、pH、温度和时间进行了探讨。     

小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后采用IPTG进行诱导表达。结果表明,成功地构建了含有小反刍兽疫病毒N基因的重组质粒pCzn1-N;诱导条件经过优化后N蛋白为可溶性表达,重组蛋白大小约为64 ku,能够与PPRV阳性血清较好地反应;制备的家兔多克隆抗体效价为1∶128 000,经过纯化后抗体效价为1∶64 000且具有较高的结合特异性;用间接ELISA和Western-blot对N蛋白纯化后制备的家兔多克隆抗体进行分析,发现重组N蛋白的免疫原性良好,且制备的多克隆抗体特异性良好。这表明重组的N蛋白具有较高的特异性及反应活性。     

用ABC-Dot-ELISA检测轮状病毒抗原与抗体

Hawkes等(1982)建立了斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)后,已有许多学者将其用于寄生虫、细菌、病毒的检测,认为比普通ELISA简单、特异、敏感、快速。70年代末建立的生物素亲和素酶联免疫吸附试验(ABC-ELI-SA),大大提高了ELISA的敏感性。我们结合两者之长,建立了生物素亲和素斑点酶联免疫吸附试验(ABC-Dot-ELISA),用于检测仔猪、羔羊及婴儿腹泻粪便中轮状病毒抗原及羊(山羊、绵羊)与人血清中的轮状病毒抗体,并同Dot-ELI-SA、ABC-ELISA及ELISA进行了比较。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其应用

为制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)单克隆抗体(MAb)及其直接荧光标记抗体,本试验用纯化的牛病毒性腹泻病毒Ht01株免疫雌性BALB/c小鼠。间接ELISA测其血清效价,取抗体效价达标小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合。用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行2次亚克隆后注射入小鼠腹腔制备单抗腹水。利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水,用间接免疫荧光试验测定其活性,用SDS-PAGE试验测定其纯度。经活性、纯度检测合格后,采用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联;用葡聚糖G-25 Medium介质进行分离纯化。结果,本研究共获得2株能够稳定分泌IgG1类型的阳性杂交瘤细胞株和一种直接荧光抗体,分别被命名为BMAb11、BMAb20、DB11。稳定性试验表明,杂交瘤细胞分泌的抗体稳定性好。ELISA、间接免疫荧光试验和直接免疫荧光试验表明,单克隆抗体和直标荧光抗体均与BVDV发生特异性反应,说明它们的特异性较好。经ELISA鉴定,腹水抗体效价达到1∶12 800。直接荧光抗体荧光素与蛋白的摩尔比(F/P)为3.34,标准值在2.0～4.0之间,符合标准。上述研究结果表明,本研究制备的单克隆抗体和直标荧光抗体可用于BVDV的检测,为BVDV的临床诊断奠定了基础。     

ABC-Dot-ELISA检测家兔抗华支睾吸虫IgG

免疫酶斑点试验(Do t-ELISA)检测抗体,具有敏感、简便等优点,因此,近年来被用于检测多种寄生虫抗原和抗寄生虫抗体。笔者利用亲和素-生物素(Avidin-Biotin)的生物放大作用,将Avidin Biotin-HRP Complex(ABC)与Dot-ELISA结合,建立了ABC-Dot-ELISA,用于检测人工感染华支睾吸虫家兔血清中的特异性IgG,同时做ABC-RLISA进行比较。(一)材料和方法1.抗原制备:按常规方法进行,蛋白质含量为5 mg/ml。2.生物素化羊抗兔地IgG(b-SARIgG)和     

氯霉素全抗原合成及多克隆抗体的制备

用重氮化方法将氯霉素与牛血清白蛋白 (BSA)和卵清蛋白 (OVA)偶联 ,制备免疫抗原和包被抗原 ,用ELISA方法进行鉴定。将偶联抗原用弗氏佐剂乳化后免疫德国大白兔 ,制备多克隆抗体 ,并用硫酸铵沉淀法初步纯化 ,用亲和层析法进一步纯化。用所得抗体建立竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于氯霉素检测 ,最低检查限为 0 .3ng/mL。     

亲合素—生物素系统在检测弓形虫抗体上的应用

应用亲合素-生物素系统(ABS)的试剂进行ABC-ELISA,并与常规ELISA和IHA予以比较,结果表明:在从90只山羊血清中检测弓形虫抗体阳性上,ABC-ELISA为56例(62.22％),常规ELISA为40例(44.44％),IHA为21例(23.33％);在检出弓形虫阳性抗体的滴度上,ABC-ELISA比常规ELISA敏感1.59倍,比IHA敏感3.07倍。ABC-ELISA与常规ELISA和IHA均呈线性正相关。因此,ABC-ELISA为弓形虫病的免疫学诊断和单克隆抗体的检测提供了比常规ELISA和IHA更敏感的新手段。     

酶标记免疫吸附试验(续)

(七)酶结合物 通过化学或免疫学方法使酶与蛋白质或小分子有机化合物(半抗原)结合,称为酶的交联或酶标记,结合的产物称酶结合物。理想的结合是既保持酶和抗体的生物学活性,又有较高的酶分子结合比率。目前酶标记抗体的方法有戊二醛法和高碘酸钠法。这里只介绍高碘酸钠法(Nakane等,1974)。     

鸭疫里氏杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测鸭疫里氏杆菌,以纯化的兔抗1型鸭疫里氏杆菌抗体作为捕获抗体,以纯化的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。最佳的方案为用184ng/孔纯化的多抗包被过夜,100mL/L小牛血清37℃封闭2h,检测抗原、单抗、酶标抗体均为37℃作用1h,显色20min后终止反应,D450nm值高于0.330且P/N>2.1判定为阳性。该方法特异性强,与禽源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌无交叉反应,最低检测剂量为104 CFU/mL。与传统细菌分离方法相比,该方法的敏感性为100%,符合率为85.2%。本研究首次建立了检测鸭疫里氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法,且特异、敏感。     

生物素—亲和素免疫酶标法检测绵羊布氏杆菌抗体的研究

本试验使用生物素——亲和素免疫酶标法(BA-ELISA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对221份绵羊布氏菌病血清抗体进行了检测,同时与常规血清学检测法进行了比较。结果表明BA-ELISA和ELISA的检出率明显高于其它方法。在其中63份菌检阳性和免疫血清中,BA-ELISA和ELISA分别检出60/63份(95.3％)和52/63份(82.5％),而试管凝集试验为20/41份(48.8％),补体结合试验为17/41份(41.5％),虎红平板试验为16/41份(39.0％),此外,还就BA-ELISA法特异性,敏感性等方面进行试验,显示出BA-ELISA具有很强的特异性,其敏感性比ELISA高4～8倍,比常规补体结合反应高256倍。这些都表明BA-ELISA是绵羊布氏菌病血清学诊断上具有发展前途的新方法。     

用酶联免疫吸附试验诊断牛伊氏锥虫病的初步研究

酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种凭借酶的作用,使免疫反应在底物上呈现出肉眼可见的色译,并可通过分光光度计或光电比色计读取不同的消光值来判断被检物的新技术。这种方法首先是1966年由Nakane和Avrameas等提出的,后来由Avrameas等(1969、1970、1971)作了较为全面的发展。它是通过化学与免疫学的方法,将酶与抗原或抗体结合起来,使其保持免疫学和酶的活性。当酶的结合物与相应的抗原或抗体结合之后,在遇到相应的酶     

基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用

本研究旨在原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epizootic diarrhea virus,PEDV)的核衣壳(N)蛋白,以重组N蛋白作为包被抗原建立PEDV血清抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。克隆PEDV N基因并将其插入到原核表达载体p ET-28a中,转化BL21感受态细胞进行诱导表达,对表达的N蛋白进行镍柱纯化及Western-blot鉴定;将纯化的N蛋白作为包被抗原并优化反应条件,建立检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达得到大小为58ku的重组N蛋白,Western-blot检测表明N蛋白具有良好的特异性和反应原性。PEDV间接ELISA方法的最优反应条件为抗原包被量每孔0.05 g,血清以1∶200倍稀释,作用1.0 h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释,作用1 h,TMB显色时间为25 min。在该优化条件下,D4500.269为阳性,反之为阴性。特异性试验表明,对PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;对96份阳性血清进行检测,敏感性为98.9%。重复性试验表明,批内变异系数0.99%~2.33%,批间变异系数3.54%~6.67%。用本试验建立的体系对临床上164份血清进行检测,阳性率为56.7%,与标准试剂盒的符合率为95.1%。总之,本试验建立的基于原核表达的N蛋白作为检测抗原的PEDV血清间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、重复性好,可用于临床PEDV血清抗体的检测。     

猪轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用差速离心法纯化的猪轮状病毒(RV)分别免疫仔猪和兔,制备了猪抗RV和兔抗RV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测RV的双抗体夹心ELISA方法.结果表明,该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:猪抗RV IgG包被浓度为4 μg/mL,兔抗RV IgG最佳工作浓度为3.5μg/mL,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1:8 000,以D<,450nm≥10.161作为阳性判定标准.该ELISA的重复性变异系数小于10 %,最低检测限为1.25μg/mL,并与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温和4℃条件下至少可保存4个月.用该ELISA方法和RV金标检测卡检测70份临床粪便样品,结果显示,ELISA的阳性检出率为22.9%,而金标检测卡的阳性检出率为20.0%.表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于RV的快速检测.     

油酸人工抗原的合成及其单克隆抗体的制备

为建立奶牛血清中油酸(OA)含量的免疫学检测方法,将油酸用活泼酯法分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,制备人工抗原和包被原;利用薄层色谱法(TLC)和红外光谱法鉴定人工抗原合成是否成功;用OA-BSA常规免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA筛选出阳性细胞株,再用有限稀释法进行亚克隆;采用小鼠体内诱生法制备腹水,Hi Trap Protein G HP纯化柱纯化腹水,并对纯化后的腹水用ELISA检测抗体效价,以及抗体亚型鉴定。结果表明,TLC监测抗原合成过程中有新物质生成,红外图谱显示OA-BSA波谱形态与BSA相似且拥有OA的特征峰;小鼠血清抗体效价为1∶12 800,用ELISA方法筛选出1株细胞G-1,抗体亚型为Ig G1型。为建立油酸的免疫学检测方法奠定了基础。     

大肠埃希氏菌表达FMDV 3AB非结构蛋白的纯化复性与活性检测

采用超声波裂解细菌 ,高浓度尿素裂解包涵体和金属螯合亲合层析的方法对大肠埃希氏菌中表达的FMDV 3AB非结构蛋白进行纯化 ,经SDS PAGE分析 ,3AB融合蛋白纯度达 90 %以上。采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对融合蛋白进行复性 ,通过Westernblotting分析 ,表明复性后的 3AB融合蛋白能与抗FMDV抗体发生特异性结合。ELISA检测表明 ,复性后的 3AB融合蛋白有很好的抗原活性。