金黄色葡萄球菌凝聚因子A区基因的克隆表达及表达产物的免疫学特性

采用PCR技术对引起乳牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌凝聚因子(ClfA)A区基因进行了扩增和克隆测序,并对测序结果用DNAStar软件进行了抗原表位分析,成功构建了原核表达质粒pET-32a-ClfA A.将其转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,证实目的蛋白以可溶形式存在.用His·Bind柱对其纯化后获得了纯度较高的蛋白.纯化后的蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔得到了较高效价的抗血清,通过ELISA、试管凝集试验、吞噬调理试验、抗体抗金黄色葡萄球菌黏附能力检测等对表达产物及制备的超免疫血清进行了检测.试验证明目的蛋白具有黏附活性,自制的超免疫血清具有抗金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原的作用以及吞噬调理作用,所表达的蛋白为ClfA A蛋白.     

口蹄疫病毒3D蛋白对DNA疫苗免疫效果的影响

将携带O型FMDVChina 99株P1 2A、部分 2B及 3C蛋白酶编码基因的真核表达质粒与在毕赤酵母中表达的纯化FMDVChina 99株 3D蛋白同时经肌肉注射方法接种豚鼠。以MTT法检测豚鼠脾淋巴细胞经植物血凝素 (PHA)刺激后的增殖活性 ,以间接ELISA方法检测血清FMDV特异抗体变化 ,并以微量中和试验检测中和抗体水平。结果表明 ,FMDDNA疫苗与 3D蛋白共同免疫豚鼠后 ,抗体水平没有明显提高 ,攻毒后的保护率为 2 5 %。     

重组蛋白P60与LLO对单核细胞增多性李斯特菌灭活疫苗的免疫增强效果

为增强单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)灭活疫苗的免疫效果,对单增李斯特菌入侵相关蛋白(P60)基因进行了克隆、表达及纯化,分别与低剂量李斯特菌溶血素O(LLO)、单增李斯特菌灭活菌混合,以MontanideISA206为佐剂制成疫苗,皮下接种家兔,并设灭活疫苗免疫组和PBS对照组,定期检测3组家兔的血清抗体、IL-4和IFN-γ水平的变化;二免后第21d每只家兔腹腔注射2×108CFU单增李斯特活菌攻毒,观察各组家兔的发病情况,每隔24h检测一次细菌在各组家兔体内的繁殖率。结果表明,添加P60和低剂量LLO重组蛋白的单增李斯特菌灭活疫苗免疫组家兔二免后抗体水平明显高于其他各组,且能诱导Th细胞向Th1型分化,抑制Th2型细胞的分化,调节抗原特异性免疫应答,能有效抵抗单增李斯特菌的感染,使细菌在家兔体内(外周血、脾)的几何增长率从64.69%降到24.06%,免疫效果明显优于灭活疫苗单独免疫组。证明P60和低剂量LLO能增强灭活疫苗的免疫保护效果。     

牛A型多杀性巴氏杆菌新型保护性抗原的筛选及鉴定

为筛选牛A型多杀性巴氏杆菌新型保护性抗原,采用生物信息学方法,对牛A型多杀性巴氏杆菌Pm CQ 2基因组中功能未知基因进行分析,从中筛选出22个具有信号肽的蛋白编码基因进行克隆表达。以Pm CQ2基因组D N A为模板,22个基因经PCR扩增分别克隆到载体p ET-30a(+)或p ET-32a(+)上,转入E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测,22个基因均获得表达。W estern-blot检测发现有8个重组蛋白与感染Pm CQ2的犊牛血清具有良好的免疫反应,以其制备抗原免疫昆明小鼠,经ELISA检测免疫小鼠血清抗体水平后,采用2 LD50的Pm CQ2腹腔攻毒测定其免疫保护效果。结果表明,8个重组蛋白均能诱导小鼠产生较高水平的抗体,其中3号和9号蛋白免疫小鼠后抗体效价达到1∶12 800,且3号和9号蛋白免疫保护效果最好,免疫保护率均为30%,其余重组蛋白的免疫保护率均较低。     

金黄色葡萄球菌Fc段受体结合蛋白A基因的克隆与原核表达

为研制葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)的相关免疫试剂盒,设计了1对引物,从金黄色葡萄球菌基因组中扩增出了876bp的细胞壁结合蛋白SPA基因,该基因编码292个氨基酸,包含了E、D、A、B、C 5个IgG结合结构域。构建了原核表达载体pET28a(+)-SPA,经IPTG诱导,表达出分子质量约35.0ku的SPA蛋白,并应用亲和层析柱纯化了SPA蛋白,Western-blot分析表明纯化的SPA蛋白具有生物学活性。     

豆状囊尾蚴外泌体的分离鉴定及其对家兔免疫应答的调节作用

为探究豆状囊尾蚴外泌体对家兔免疫应答的调节作用,以收集的豆状囊尾蚴分泌排泄产物(ESP)为材料,通过差速离心法分离外泌体,经透射电镜和Western-blot分别对其形态和标志分子进行鉴定。分别用外泌体和ESP免疫家兔,ELISA方法检测家兔血清中特异性抗体和血清细胞因子水平,并通过人工攻虫感染评价其免疫保护效果。结果显示,豆状囊尾蚴外泌体直径为30~150 nm,呈圆形或椭圆形,有完整的脂质双分子层膜结构,且含有外泌体标志蛋白CD63。而且,外泌体免疫组血清特异性抗体、IL-10和IL-4的水平显著升高(P<0.05),而IFN-γ和TNF-α显著降低(P<0.05)或差异不显著。经剖检发现,豆状囊尾蚴ESP免疫组和外泌体免疫组的减虫率分别为65.17%和24.88%。结果表明,外泌体通过上调宿主抑炎因子的表达,诱导宿主产生了Th2型细胞免疫应答,从而有利于囊尾蚴在宿主体内的存活。     

内江猪IL-15基因的表达与免疫增强作用研究

参照GenBank中猪IL-15基因的mRNA序列设计1对特异性引物,从经由刀豆蛋白A诱导培养的内江猪外周血淋巴细胞扩增猪IL-15基因;构建其成熟肽原核表达载体pMAL-pIL-15,在Rosetta(DE3)pLysS中表达;构建其真核表达载体pCI-pIL-15,与pCI-gD(PRV)联合免疫雌性BALB/c小鼠以研究其免疫增强作用.测序结果显示,内江猪IL-15基因与发表的猪IL-15基因的核苷酸同源性为97%～99%,含489 bp的完整开放阅读框.SDS-PAGE分析显示,表达的融合蛋白约为52.5 ku,约占菌体总蛋白的27%.Western-blot检测显示,所表达的融合蛋白为麦芽糖结合蛋白的融合蛋白.MTT法试验证实,该融合表达产物经初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞增殖;小鼠免疫试验显示,pCI-pIL～15能够促进小鼠脾CD4+、CD8+T细胞增殖,加强PRV-gD基因疫苗特异性中和抗体的产生.     

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染对BMEC炎性因子mRNA表达的影响

为了探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)在不同时间点对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)相关炎性因子转录水平的调节作用。本试验通过体外培养BMECs并对其进行免疫细胞化学方法鉴定。选取纯化后的原代BMECs,分别加入活菌比(MOI)为100∶1的最佳浓度的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌对细胞进行感染,分别在感染后第0、3、6、9、12小时采样,采用qRT-PCR法检测IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达情况。结果显示,在添加1×102CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第6小时IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。在添加1×101CFU/m L大肠杆菌作用至第6小时,IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L大肠杆菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L大肠杆菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。本试验结果表明,使用最佳浓度金黄色葡萄球菌或大肠杆菌作用于BMECs时,在最佳感染时间点可显著上调IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达量。IL1R1、IL-1β及TNF-αmRNA表达量在临床上可作为创伤后炎症反应的敏感指标,能评价炎症反应的严重程度,对乳腺炎的病程诊断具有重要意义。本试验结果为进一步研究细菌感染引起乳腺炎的致病机理提供了理论依据。     

猪脑心肌炎病毒P1和P12A3C基因重组腺病毒的构建及其在小鼠体内的免疫应答

为研制脑心肌炎病毒(EMCV)新型活载体疫苗,首先将病毒核衣壳前体多肽P1与P12A3C串联基因分别插入穿梭质粒pDC316中,构建得到了重组穿梭质粒pDC316-P1和pDC316-P12A3C。将其分别与辅助质粒pBHGloxΔE1、3Cre共转染293细胞,成功包装出重组腺病毒Ad-P1和Ad-P12A3C。免疫过氧化物酶单层试验确证,重组腺病毒可表达目的蛋白。分1次和2次肌肉注射免疫小鼠,然后通过间接ELISA试验和中和试验评价其诱导的特异性体液免疫水平。结果,Ad-P1诱导的VP1特异总抗体IgG水平显著高于Ad-P12A3C,但不能检测到明显的中和抗体(<1∶8);Ad-P12A3C能诱导产生良好的中和抗体(1∶32~1∶128),用1×108TCID50剂量EMCV BJC3株攻毒,Ad-P12A3C免疫组能获得100%的保护,而Ad-P1免疫组仅能获得部分保护。以上结果表明,Ad-P12A3C可作为良好的EMCV腺病毒活载体疫苗。     

鸡CTLA-4胞外区的原核表达与免疫佐剂作用

为了探索鸡细胞毒性T细胞相关抗原-4(CTLA-4)胞外区(ChIgV)作为免疫佐剂的可行性,采用RT-PCR从鸡外周血淋巴细胞扩增ChIgV编码序列;测序结果显示,其核苷酸序列与已发表序列的同源性为100%。将猪CD151基因片段克隆入原核表达载体pET-30a和ChIgV融合表达载体pET-ChIgV,获得重组表达载体pET-CD151和pET-ChIgV-CD151。分别将pET-CD151和pET-ChIgV-CD151转化BL21(DE3)大肠杆菌,用IPTG诱导重组菌表达,SDS-PAGE结果显示,能表达预期的18ku和28ku重组蛋白,表达产物均为不溶性包涵体。采用包涵体纯化法和尿素变性/复性法获得了纯化的可溶性重组蛋白。以每只500μg剂量2次免疫SPF鸡,用间接ELISA测定血清抗体效价,结果显示,CD151免疫组在初免后第3周特异抗体检测为阳性,第5周抗体效价达到1∶13 000;ChIgV-CD151免疫组在初免后第2周特异抗体检测为阳性,第4周抗体效价达1∶53 000。分别用CD151和ChIgV-CD151免疫血清进行Western-blot检测,结果显示,均能在CD151阳性猪肺巨噬细胞膜蛋白中检测到预期的29ku蛋白条带,而在CD151阴性PK-15细胞膜蛋白中不能检测到相应的蛋白条带。表明,ChIgV可作为鸡抗原提呈细胞的靶向导入分子和新型免疫佐剂。     

环形泰勒虫TaSDP基因的原核表达及TaSDP蛋白多克隆抗体的制备

利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增TaSDP(Theileria annulata schizont-derived protein)基因,用获得的基因片段构建原核表达载体pET-30a(+)-TaSDP,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,蛋白以包涵体的形式存在;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并分别用ELISA和Western-blot测定抗体的效价及特异性。结果显示,获得的TaSDP基因的长度为552bp,制备的多克隆抗体不仅可与重组蛋白His-TaSDP发生反应,而且可以识别天然的虫体蛋白,效价高于1∶215。上述研究结果为开展TaSDP在细胞调控方面的研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒pNP419L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了评估原核表达的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pNP419L蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值,将PCR扩增的NP419L基因片段插入载体pET-28a中,然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,以金属离子层析法纯化蛋白后,免疫新西兰大白兔制备家兔抗pNP419L多克隆抗体。结果显示,用PCR成功地扩增了NP419L基因序列,NP419L基因转入表达载体后被成功表达;纯化后的重组pNP419L蛋白的分子质量为42 ku;用间接ELISA检测家兔源多克隆抗体的效价达到1∶512 000,IFA试验及Western-blot检测表明该多克隆抗体具有良好的反应性及特异性。本研究为pNP419L蛋白生物学功能的研究奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株F基因的克隆与原核表达

提取小反刍兽疫病毒(PPRV)疫苗株Nigeria 75/1的总RNA,用RT-PCR方法扩增F基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒为模板克隆去掉N端信号肽和跨膜区的F基因(F-1)并亚克隆于原核表达载体pET-30a(+),得到重组质粒pET30-F-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫SPF家兔制备抗体,进行间接免疫荧光检测并用ELISA测定抗体效价.结果显示,目的基因正确插入了表达载体,在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,用重组蛋白免疫3次后,兔血清抗体达到较高水平,Western-blot分析说明表达产物能够与兔血清抗体发生特异性反应,间接免疫荧光试验显示重组蛋白免疫兔阳性血清能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原.表明,重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达,并且具有较好的反应原性.     

表达猪瘟病毒E2蛋白的三种重组腺病毒在兔体上的免疫效力比较

为了筛选1株免疫效果好的候选猪瘟疫苗,在家兔模型上对表达猪瘟病毒E2基因的3种重组腺病毒(rAdV-E2、rAdV-optiE2和rAdV-E2UL49)进行了免疫效力评价,从抗体、攻毒后产生定型热反应以及兔脾中病毒载量等几个方面进行了比较。结果显示,rAdV-E2UL49免疫组(n=5)在免疫后第2周,3只家兔产生了特异性的猪瘟抗体,免疫后第4周,所有免疫家兔的抗体阻断率均达到了70%;相比之下,rAdV-E2和rAdV-optiE2免疫组(n=5)家兔在免疫后第4周,只有个别家兔检测到了猪瘟特异性抗体。用猪瘟弱毒疫苗(C株)攻毒后,rAdV-E2UL49免疫组家兔均未出现定型热反应,在其脾中也未检测到C株病毒RNA,其免疫效果接近于C株;rAdV-E2和rAdV-optiE2免疫组各有3只家兔出现了定型热反应,在个别兔的脾中检测到了病毒RNA。结果表明,伪狂犬病病毒UL49基因编码的VP22蛋白可以增强重组腺病毒的免疫原性,rAdV-E2UL49有望成为一株有潜力的猪瘟疫苗。     

猪传染性胃肠炎病毒S-N融合双基因疫苗的构建及其免疫原性分析

为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基因的重组质粒pVAX-S-N,将pVAX-S-N转染COS7细胞以免疫荧光试验进行S、N双基因的表达鉴定。用纯化的pVAX-S-N和作为对照的pVAX-S、pVAX1、PBS免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,分别测定免疫后第0、14、28、42天的小鼠血清IgG抗体,测定免疫后第42天小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的数量。结果,融合质粒pVAX-S-N可在COS7细胞特异性表达S、N两个蛋白,pVAX-S-N免疫小鼠后第14天即可诱导产生抗TGEV的特异性IgG,但pVAX-S-N诱导的抗体水平一直低于pVAX-S诱导的抗体水平,在免疫后第42天差异极显著(P<0.01);pVAX-S-N可激发小鼠产生细胞免疫应答,但pVAX-S-N组的CD3+、CD4+、CD8+数量均低于pVAX-S免疫组。研究结果表明,融合双基因疫苗pVAX-S-N具有免疫原性,但免疫效果却不如单基因疫苗pVAX-S的理想。     

鹅Ⅰ型禽副黏病毒F基因重组质粒的构建及其DNA免疫

通过RT PCR扩增出鹅Ⅰ型禽副黏病毒GPMV/QY97 1株F蛋白基因的cDNA ,并将F基因cDNA克隆到含CMV启动子的pCI载体上 ,构建这一基因的真核表达质粒pC GPMVF ,以此质粒肌肉注射 3周龄非免疫鸡 ,并分别于免疫后第 2、4、6周通过ELISA方法检测抗体水平。结果证明 ,用重组质粒pC GPMVF免疫鸡 ,能刺激机体产生抗Ⅰ型禽副黏病毒的特异性抗体和免疫应答     

羊口疮病毒F1L与B2L基因核酸疫苗联合免疫小鼠特性的研究

为评价羊口疮病毒(OrfV)F1L与B2L基因核酸疫苗PVAX1-F1L、PVAX1-B2L联合免疫小鼠诱导体液和细胞免疫的应答效果,分别将PVAX1-F1L+PVAX1-B2L、PVAX1-B2L、PVAX1-F1L、PVAX1空载体与PBS通过后腿肌肉注射方式免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫不同时间段的小鼠血清中OrfV特异性抗体及细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ,并通过MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,PVAX1-F1L+PVAX1-B2L联合免疫组小鼠血清抗体效价及IL-2、IFN-γ细胞因子水平显著(P<0.05)高于PVAX1-F1L和PVAX1-B2L单独免疫组,IL-4细胞因子水平差异不明显,但均与PVAX1空载体和PBS组差异极显著(P<0.01);PVAX1-F1L+PVAX1-B2L联合免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖水平与PVAX1-F1L和PVAX1-B2L单独免疫组相比,差异显著(P<0.05),与PVAX1空载体和PBS组相比,差异极显著(P<0.01)。结果表明,PVAX1-F1L+PVAX1-B2L联合免疫小鼠能够增强OrfV特异性抗体的分泌和细胞免疫应答,这为羊口疮新型疫苗的研制奠定了理论基础。     

应用IgG-SPA菌免疫法制备兔抗豚鼠IgG血清

第二抗体是免疫学研究及临床检验工作中经常应用的重要试剂之一,但目前制备第二抗体,仍多用常规的佐剂免疫法进行,既复杂又费时费力。笔者依据金黄色葡萄球菌细胞壁上的A蛋白,能与豚鼠IgG的Fc段结合的特性,将含A蛋白的葡萄球菌(SPA菌)与豚鼠全血清作用,制成IgG-SPA菌液,作为免疫原,给兔静脉注射,制备兔抗豚鼠的IgG血清,获得了较满意的结果。 (一)材料 1.菌种:含A蛋白金黄色葡萄球菌Cowan I,菌种编号26111,购自卫生部药品生物制品检定所。     

A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒的构建及其免疫效力的研究

为构建A型塞内卡病毒(SVA)P12A-3C基因的真核表达质粒,提取SVACH-FJ-2017株的RNA,经RT-PCR方法扩增得到衣壳前体蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因,利用融合PCR方法获得P12A-3C基因并将其构建到真核表达质粒pc DNA~(TM)3.1/myc-His(-)上,获得表达质粒pCD-P12A-3C,用脂质体Lipofectamine~(TM)2000将该质粒转染293T细胞后,进行间接免疫荧光(IFA)检测;且用Myc单抗和SVA VP1单抗进行Western-blot分析;大量提取并纯化表达质粒,免疫小鼠后用间接ELISA法检测抗体水平变化情况。结果,SVA真核表达质粒pCD-P12A-3C经酶切及测序鉴定证明构建正确,转染293T细胞后IFA可见明显的绿色荧光,表明P12A-3C基因可在细胞内表达;将转染细胞裂解后进行Western-blot分析,结果显示该质粒可表达3C蛋白,且表达产物可与SVA VP1单抗发生特异性反应;免疫小鼠后抗体检测结果表明,二免后第14天,免疫小鼠抗体水平比对照组明显增高;该结果表明本研究构建的真核表达质粒pCD-P12A-3C可正确表达相应蛋白,且所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。结论:本研究成功构建了A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒并进行了免疫效力初步验证,为A型塞内卡核酸疫苗的研制奠定了基础。     

可介导多药耐药的cfr基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为建立监测Cfr蛋白的方法奠定基础,采用PCR方法扩增cfr基因,并克隆入pEasy-T载体;测序确认后克隆入pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-cfr,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并用IPTG诱导表达Cfr蛋白;用纯化的Cfr蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对抗体进行鉴定。结果显示,成功克隆了全长cfr基因,构建了重组质粒pET-28a-cfr,并诱导了Cfr蛋白表达以及制备了小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体;Western-blot法鉴定该抗体可特异性识别重组蛋白Cfr;ELISA法测定抗体效价为1∶64 000。结果表明,用大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达Cfr蛋白,并且获得了高特异性、高效价的小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体。