羊巴贝斯虫SBP3基因序列分析和诊断标识潜力评价

以GenBank中公布的巴贝斯虫球状体蛋白3(spherical body protein3,SBP3)基因序列为模板,设计合成特异性引物,从我国分离的6株羊巴贝斯虫基因组DNA和cDNA中扩增SBP3基因全长序列;利用生物信息学分析软件,进行基因序列比对、结构特征分析和遗传进化分析,以阐明我国羊巴贝斯虫SBP3基因特性和各虫株间的分类关系;以SBP3基因作为靶标基因,建立巢式PCR检测方法,评价其作为诊断标识基因的潜力。结果显示,羊巴贝斯虫SBP3基因无内含子,其中羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株、莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株和莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株的SBP3基因全长分别为3 195 bp、3 351 bp和3 348 bp;遗传进化分析结果显示,我国分离的6株羊巴贝斯虫可分为2个种,其中莫氏巴贝斯虫可能存在2个亚种;以SBP3为靶标分子建立的巢式PCR可特异性鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫,且与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊无浆体无交叉反应,检测羊巴贝斯虫未定种最低检测限为5 pg,检测莫氏巴贝斯虫最低检测限为0.5 pg。本试验将为进一步探究羊巴贝斯虫SBP3蛋白功能及羊巴贝斯虫流行病学调查提供数据和技术支持。     

我国羊巴贝斯虫bov57基因的结构与遗传进化分析

通过对我国羊巴贝斯虫bov57基因进行克隆、序列比对和进化分析,为研究bov57基因功能及我国羊巴贝斯虫分类提供基础数据支持。以NCBI数据库中公布的卵形巴贝斯虫和牛巴贝斯虫bov57基因序列BLAST我国2个羊巴贝斯虫基因组数据库,获得羊巴贝斯虫bov57基因的保守序列,以此为模板设计引物;扩增我国6株羊巴贝斯虫的bov57基因,分析其结构特征,并进行序列比对,构建系统进化树,分析遗传进化关系。结果显示,这6株羊巴贝斯虫bov57基因均无内含子,羊巴贝斯虫未定种敦煌株/新疆株(BspDH/XJ)和莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株(Bm LT/TZ)bov57基因ORF的大小为1 608 bp,编码536个氨基酸;莫氏巴贝斯虫河北株/宁县株(Bm HB/NX)bov57基因ORF的大小为1 605 bp,编码535个氨基酸。序列比对结果显示,羊巴贝斯虫未定种与莫氏巴贝斯虫bov57基因核苷酸序列的相似性为58.84%～61.71%,氨基酸序列的相似性为45.93%～50.93%;莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株和莫氏巴贝斯虫河北株/宁县株的核苷酸序列相似性为85.29%～85.60%,氨基酸序列相似性为75.19%～75.74%。遗传进化分析结果表明,我国的这6株羊巴贝斯虫分为2个种,而莫氏巴贝斯虫可能存在2个亚种。     

我国羊巴贝斯虫棒状体颈部蛋白RON2基因的克隆与结构和遗传进化分析

用牛巴贝斯虫棒状体颈部蛋白RON2基因序列BLAST我国羊感染的2种巴贝斯虫全基因组数据库,以获得的RON2基因保守序列片段为模板设计PCR引物;从6株羊巴贝斯虫基因组DNA和c DNA中扩增RON2基因全长序列,分析其基因结构特征;并通过序列比对和进化树构建,分析我国羊巴贝斯虫的遗传进化关系。结果显示,该基因无内含子,羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株(BspX J/DH)、莫氏巴贝斯虫天祝株/临潭株(BmTZ/LT)和莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株(BmNX/HB)RON2蛋白基因ORF的大小分别为4 029、4 047和4 044 bp,编码1 345、1 349和1 348个氨基酸。RON2蛋白的分子质量约为151 ku,等电点为8.91,具有3个跨膜区,N端第1～29位氨基酸为其信号肽区域。RON2核苷酸和氨基酸序列比对分析结果显示,BspXJ/DH与BmTZ/LT和BmNX/HB的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为67.0%～67.4%和69.2%～69.3%,BmTZ/LT和BmNX/HB间的相似性分别为92.8%～92.9%和91.1%～91.2%。系统发生树上羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫分别位于2大支,莫氏巴贝斯虫又被分为2小支。该结果为开展我国羊巴贝斯虫的分类关系和RON2基因功能的研究提供了基础数据。     

建立在PCR-RFLP方法基础上的羊梨形虫的种类鉴定

羊的梨形虫病在世界范围内广泛分布,由多种泰勒虫和巴贝斯虫引起。在我国主要有莫氏巴贝斯虫、羊巴贝斯虫未定种、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫,给我国畜牧业造成了巨大的经济损失。为了快速准确地鉴定羊梨形虫,作者运用PCR技术扩增了梨形虫的18 S rRNA基因,然后再分别用内切酶ClaⅠ、Sau96Ⅰ和MboⅡ酶切扩增产物,根据酶切后限制性片段多态性的不同,建立了PCR-RFLP方法,达到了鉴定莫氏巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫的目的,为梨形虫的分类和流行病学调查提供了新的方法。     

卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种检测感染牛的卵形巴贝斯虫的敏感、快速方法,本研究根据GenBank中登录的卵形巴贝斯虫18S rRNA保守区设计1对特异引物,通过优化反应条件,建立了检测卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异地检测出卵形巴贝斯虫DNA,对瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫DNA的检测均为阴性;该方法的灵敏度可达1.26 copies/μL,比普通PCR灵敏度高100倍。组内及组间重复试验的变异系数均小于3%。对60份临床牛血液DNA样本进行检测,荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为41.67%和33.33%。结果表明,本试验建立的荧光定量PCR方法可用于对卵形巴贝斯虫定量分析和卵形巴贝斯虫病的分子流行病学调查。     

莫氏巴贝斯虫trap基因的克隆表达及反应原性分析

本研究以莫氏巴贝斯虫临潭株为研究对象,分别从其基因组D N A和c DNA中成功扩增trap基因全长,应用生物信息学分析软件分析验证了该基因和蛋白的结构;构建p ET-30a-trap原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达;表达产物超声破碎后,对上清和沉淀进行SDS-PAG E分析。纯化可溶性的r Bm TRAP,W estern-blot分析其反应原性。结果显示,莫氏巴贝斯虫trap基因具有4个内含子和5个外显子,开放阅读框大小为2 100 bp。第1~23位氨基酸为信号肽序列,第45~201和第238~302位分别为TRAP蛋白家族的v WA和TSP1结构域;重组蛋白r Bm TRAP以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株阳性血清可特异性识别r Bm TRAP,而与莫氏巴贝斯虫宁县株和河北株、羊巴贝斯虫未定种新疆株和敦煌株、吕氏泰勒虫和羊无浆体阳性血清无交叉反应。结果表明,r Bm TRAP具有作为血清学诊断方法候选抗原的潜力,为将来建立鉴别诊断莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株感染的免疫学诊断方法奠定了基础。     

羊源巴贝斯虫未定种甘肃敦煌株的发现

采用动物接种法将采自甘肃敦煌的15只绵羊血液混合后感染1只除脾绵羊,感染后逐日做血涂片检查。结果显示,在感染后第10天的血片上出现了1种大型巴贝斯虫。虫体形态以双梨子形、单梨子形、圆形及卵圆形为主。在感染后第12天,感染羊体温升至41.1℃。染虫率达到0.125%,之后逐渐下降。无菌采集该羊血液,提取全血基因组,用梨形虫通用引物进行PCR扩增全长18SrRNA基因,得到长约1 700bp的片段,将其克隆并测序(登录号:HQ730762),与GenBank中的其他巴贝斯虫的序列进行比较,发现其与新疆巴贝斯虫未定种的同源性最高,达到99.8%。本研究发现甘肃敦煌又是一个新疆羊巴贝斯虫未定种的疫源地。     

莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫在我国的分离及形态学观察

在甘肃省庆阳地区的发病及病愈的小尾寒羊血液中分离出２种巴贝斯虫并进行了形态学观察，初步证实该地区“坏肠子”病的病原为巴贝斯虫，一种小型虫体鉴定为羊巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａｏｖｉｓ）。另一种为大型虫体，鉴定为莫氏巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａｍｏｔａｓｉ）。含羊巴贝斯虫的血液注射给除脾羊后，第１４ｄ血涂片中红细胞的染虫率达最高点（为０．５％），之后逐渐下降，感染羊自然耐过。含有混合虫种的血液注射给易感除脾羊后，红细胞染虫率迅速上升至３０．０％，感染后第６ｄ羊因巴贝斯虫病死亡。对２种虫体做了量度和形态学描述，并与欧洲的相同虫种作了比较。     

边缘无浆体SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中边缘无浆体的MSP4基因序列(EU677383)设计2对引物(AmspF3/R3和Am-spF4/R4)并克隆MSP4部分基因,构建含有MSP4基因的标准质粒,以AmspF3/R3为引物进行荧光定量PCR,建立了边缘无浆体的MSP4SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并用于临床血样检测。结果显示,该方法可以检测到1×102 copies/μL的标准质粒DNA,该方法对绵羊无浆体、附红细胞体、东方巴贝斯虫、组织滴虫提取的DNA均为阴性反应。结果表明,该方法与常规PCR方法比较,阳性及阴性符合率都为100%,且具有敏感、重复性好、无污染特性,并具有能准确定量的特点,说明该方法具有很好的应用前景和研究价值。     

牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法的建立

为建立一种适用于基层兽医实验室特异、敏感、快速检测牛巴贝斯虫感染的方法,以牛巴贝斯虫球状体蛋白4(SBP4)基因为靶基因设计引物,建立检测牛巴贝斯虫的巢式PCR方法。结果表明,该方法可特异性地检测牛巴贝斯虫感染,与14种动物梨形虫无交叉反应。该方法能够检测到1 copy的SBP4基因,其敏感性分别是对应的内、外引物普通PCR的10倍和1 000倍。应用该巢式PCR方法,对田间随机采集的136份野外样品进行检测,检出阳性样品9份,显著高于AbouLaila等报道的方法(5份)。这些数据表明,建立的巢式PCR方法可用于基层兽医实验室敏感、准确地检测牛巴贝斯虫感染。     

应用三磷酸核苷水解酶基因检测弓形虫方法的建立

用Primer Explorer V4软件针对弓形虫三磷酸核苷水解酶(NTPase)基因设计了6条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,建立弓形虫LAMP反应体系,并进行特异性和敏感性试验。结果显示,用该反应体系30 min即可检测出弓形虫NTPase基因,产生瀑布状的特异性条带,检测极限为20 copies,敏感性比PCR高10倍。与犬新孢子虫、鹦鹉热衣原体、柔嫩艾美耳球虫、吕氏泰勒虫、羊巴贝斯虫未定种和牛巴贝斯虫间无交叉反应,且重复性良好。应用此方法,可以在攻虫后第2天于试验猪血液中检测出弓形虫,比PCR方法提前2 d。表明将弓形虫NTPase基因作为环介导等温扩增检测弓形虫的目的基因,具有特异性强、敏感性高的特点,是快速诊断弓形虫病的一种新方法。     

牛巴贝斯虫病ELISA诊断方法的建立

以BORCT蛋白为包被抗原,优化最佳反应条件,确定阈值并测定其交叉反应,建立了一种特异性检测牛巴贝斯虫抗体的间接ELISA方法。利用该方法测定了试验感染的2头牛的抗体动态曲线,并对我国四川、甘肃、新疆3个省(自治区)的314份牛血清样品进行了检测。结果显示,经MedCalc 12.7.3.0软件分析86份阴性血清和69份阳性血清的检测结果,确定29.6%抗体比率为该方法的阳性阈值,对应的敏感性和特异性分别为94.2%和96.5%,并且与其他巴贝斯虫、泰勒虫和无浆体阳性血清均无交叉反应。对试验感染动物的检测结果显示,感染后的第6天出现特异性抗体,第12天达到最高值,一直持续到第270天。野外样品检测结果显示,3个省份均有牛巴贝斯虫的分布,平均阳性率为46.82%。     

犬源韦氏巴贝斯虫的分子鉴定和系统发育研究

无菌采集疑似巴贝斯虫感染血样,进行全血基因组DNA的抽提,用保守引物5-22F和1661R进行巴贝斯虫18SrRNA基因的PCR扩增,扩增产物经克隆、测序后,获得大小为1 677bp的核苷酸序列。序列比对和系统发育分析发现,该序列与韦氏巴贝斯虫(AB083374)18SrRNA基因的相似性达100%,而与犬巴贝斯虫(AY072926)、罗氏巴贝斯虫(L19079)和吉氏巴贝斯虫(AF271081)18SrRNA基因的相似性分别为98.0%,95.2%和93.4%。从分子水平证实了韦氏巴贝斯虫在广东宠物犬的存在,同时也对巴贝斯虫的分类进行了讨论。     

浅谈卵形巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫病

Minami等(1980)在发表卵形巴贝斯虫(Babesiaovata Minami and Is-hihara,1980)新种时的文章中回顾到,自1911年Tokishige首次报告日本的牛感染有巴贝斯虫以来,许多学者对分布于日本(除冲绳而外)牛的一种大型的巴贝斯虫未定种进行了长时间的研究,对分类地位进行了讨论。To-kishige和Ogura(1929)把这个种认作为双芽巴贝斯虫(B.bigemina)或与此相关的种,而Iseki(1924)却认为是与牛巴贝斯虫(B.bovis)或分歧巴贝斯虫(B.divargens)相关的种。Ishiha-ra(1968)证实,日本牛的巴贝斯虫是由纽曼氏血蜱(Haemaphysalis neumanni,即H.longi-cornis)通过次代幼虫传播,同时也指出该种在     

田鼠巴贝斯虫醛酮还原酶BmAKR2的基因克隆和鉴定

为了解田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)在富氧环境下的抗氧化能力,克隆了田鼠巴贝斯虫醛酮还原酶(aldo-keto reductases,AKRs)基因并进行了鉴定。全长的田鼠巴贝斯虫醛酮还原酶(BmAKR2)包含2 490 bp的阅读框,编码829个氨基酸。经BLAST分析,发现该蛋白质在第172~542位氨基酸残基区域存在典型的AKR结构域。将该酶的结构域克隆到表达质粒pGEX-4T-1中,然后转化到BL21(DE3)中进行原核表达,获得了GST融合重组蛋白GST-BmAKR2-HX。使用该重组蛋白免疫小鼠制备抗体,Western-blot鉴定结果显示,天然BmAKR2蛋白的分子质量为96 ku,与预测的大小一致。间接免疫荧光试验结果显示BmAKR2定位于田鼠巴贝斯虫裂殖子的细胞核。通过实时荧光定量PCR分析,表明BmAKR2在感染小鼠的第2~14天内均表达,其中第5天为表达峰期。     

含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测方法的建立

为了提高犬巴贝斯虫的PCR检测方法准确性,采用复合引物重组方法构建两端含有检测巴贝斯虫18S r RN A基因的PCR检测引物的扩增内标质粒(含鸡特异性基因片段),通过优化扩增内标质粒的添加量,建立了一种新的检测犬巴贝斯虫PCR方法。结果显示,在25 L的PCR反应体系中加入1×106copies的扩增内标的可有效地检测犬巴贝斯虫基因组D NA,该PCR方法最低检测限为1×105copies。本试验建立的含扩增内标的PCR检测方法能快速、准确、简便的检测犬巴贝斯虫感染,同时能有效的避免假阴性现象的产生。     

金华市部分乡镇奶牛巴贝斯虫病的流行病学调查

为有效防控金华市奶牛巴贝斯虫病,根据牛巴贝斯虫病间接ELISA检测方法,以纯化的重组蛋白GST-MSA-2c作为抗原,对2009-2011年金华市7个乡镇的奶牛巴贝斯虫病进行了流行病学调查。结果显示,金华存在奶牛巴贝斯虫病,在2009年采集的296份牛血清样品中,阳性血清11份,感染率为3.72%;在2010年的306份牛血清样品中检出阳性血清14份,感染率为4.58%;在2011年的307份牛血清中检出阳性血清11份,感染率为3.58%。结果提示,金华市奶牛巴贝斯虫感染率以农户散养最高,建立集约化养殖制度和家畜原虫病综合防疫措施迫在眉睫。     

牛无浆体PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、特异、敏感的牛无浆体(Anaplasma bovis)PCR检测方法及了解新疆部分地区牛无浆体感染情况,根据牛无浆体16S rRNA基因序列(MH255941.1)设计1对引物,建立了检测牛无浆体PCR方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验、临床样品检测及系统进化分析。结果显示,所建立的方法能特异性地鉴别牛无浆体,与环形泰勒虫(Theileria annulata)、绵羊无浆体(A. ovis)、牛巴贝斯虫(Babesia bovis)、双芽巴贝斯虫(B. bigemina)基因组均无交叉反应,该方法检测下限可达到1.02×10~(-18)g/μL,比文献报道的PCR敏感10倍(8.9×10~(-18)g/μL);具有良好的重复性;对94份牛临床血液样品检测结果表明,牛无浆体的阳性率为54.3%(51/94),高于文献报道的PCR方法的检测结果 37.2%(35/94);系统进化树显示,三个地区的牛无浆体菌株都不在同一分支上。结论,成功构建了牛无浆体PCR快速检测方法,这为牛无浆体的快速诊断及流行病学调查奠定基础。     

人的巴贝斯焦虫病

1888年Babes首次在罗马尼亚的牛、羊血液中发现巴贝斯焦虫(Babesia)以来,已90多年了。目前它仍是热带和亚热带地区危害牛的重要血液寄生虫。以前一直认为各种巴贝斯焦虫株具有严格的宿主特异性,但自1957年发现第一个人感染巴贝斯焦虫的病例至今,见于报道的人巴贝斯焦虫病已有17例。通过染色血液涂片显微镜检查、实验室动物分离和血清学方法。将感染人的巴斯焦虫鉴定为:四个属于牛源——牛巴贝斯焦虫(Babesia bovis)和分歧巴贝斯焦虫(Babesia divergens);一个属于马源——马巴贝斯焦     

犊牛摘脾术的发展现状

摘脾术已广泛应用到某些蜱媒疾病的研究和防制技术中,如在摘除脾脏的动物体内繁殖边虫(Anaplasma)、巴贝斯虫(Babesia)、附红小体(Eperythrozoon)等病原体,供制备诊断液或疫苗。澳大利亚蜱热病研究中心(TickFever Research Centre)是一个具有40年历史的专业研究机构,1956年开始用摘脾牛研制巴贝斯虫病和边虫病的诊断制剂和疫苗。1986年增添了一